Latrasfezione è il processo di introduzione di materiale biologico esogeno incelluleeucariotiche, nella gran parte dei casi dimammifero. È più frequente l'inserimento di materiale genetico, tra cui solitamenteDNA esiRNA, ma, in generale, possono essere trasfettate ancheproteine (come ad esempioanticorpi). Il processo e i metodi per attuarlo sono analoghi a quelli per latrasformazione batterica, che però riguardabatteri e, talvolta, le cellule vegetali.
Il processo di trasfezione può essere fatto:
La trasfezione è utile in tutti gli studi digenetica ebiologia molecolare che vogliano ottenere informazioni sull'attività e la funzione di determinatigeni. Questo può essere fatto, generalmente, in due modi: sovraesprimendo il gene in questione oppure silenziandolo.
Nel primo caso si induce quindi una produzione superiore al normale del prodotto genico inserendo ulteriori copie dello stesso gene, ad esempio. Nel secondo caso il gene invece sarà "bloccato".
Due sono i metodi per silenziare un gene.
In tutti i casi le colture trasfette saranno seguite e saranno analizzate le eventuali conseguenze.
A seconda del destino in cui incorre ilvettore inserito si può distinguere tra trasfezionetransiente e trasfezionestabile. La trasfezione è transiente quando il vettore resta nella cellula come frammento extracromosomico, cioè non si integra nelgenoma cellulare; in questo caso le proprietà indotte dalla trasfezione permangono per breve tempo, di solito scompaiono prima delle 72 ore. La trasfezione è stabile, invece, quando il DNA esogeno si integra stabilmente nel genoma: l'effetto quindi rimane per l'intera vita della cellula e sarà trasmesso anche alle cellule che ne derivano.
La trasfezione transiente è certamente più rapida, facile ed economica, ma ovviamente permette studi limitati nel tempo. La trasfezione stabile si ritiene necessaria ogni volta che l'effetto genico è a medio-lungo termine: ad esempio quando si studiano geni che si ritengono connessi ai processi didifferenziamento cellulare.
Indipendentemente dal tipo di trasfezione e dal metodo utilizzato, è necessario sviluppare delle tecniche che rendano possibile, nella coltura cellulare, l'isolamento solo delle cellule in cui il processo di trasfezione è effettivamente avvenuto. Questa funzione viene svolta dall'azione di alcune sequenze contenute nel vettore assieme al gene d'interesse. Due sono le tecniche principali:
Considerando il caso più generale, l'introduzione di DNA, il problema che si pone riguarda il fatto che sia l'acido nucleico che lamembrana cellulare sono carichi negativamente: il DNA, per forze di repulsioneelettrostatiche, quindi, non interagirà mai spontaneamente con la membrana. Molti metodi di trasfezione servono infatti per mascherare i gruppi anionici del DNA.
Uno dei metodi più semplici e meno costosi è quello che utilizza il fosfato di calcio, sviluppato per la prima volta da Bacchetti e Graham nel1977[1]. La procedura prevede il mescolamento di unasoluzione tampone diHEPES contenenteionifosfato insieme a una soluzione dicloruro di calcio (CaCl2) e il DNA da trasfettare. Il mescolamento delle due soluzioni produce un precipitato di calcio fosfato, che andrà a legare la molecola di DNA. Il precipitato viene prelevato, risospeso e aggiunto al terreno di coltura (di solito una coltura mono strato). Con un processo ancora non ben noto le cellule legano il precipitato e permettono l'ingresso del DNA. La precipitazione può avvenire anche con dietil-ammino-etil-destrano.
Un altro metodo biologico molto efficace sfrutta iliposomi, piccolevescicole lipidiche che inglobano il DNA e sono indotte ad entrare con esso nella cellula simulando i processi diendocitosi cellulare.
Un altro metodo prevede l'uso didendrimeri, molecole altamente ramificate che si legano al DNA e lo trasportano nella cellula.
Un metodo tra i più usati è laelettroporazione, che consiste nell'applicare unadifferenza di potenziale ai lati della cuvetta che contiene la soluzione con le cellule e il DNA da inserire: loshock elettrico provoca la formazione di pori nella membrana che permettono l'ingresso del materiale genetico. Ha come difetto un'elevata percentuale di cellule che non sopravvivono in seguito al trattamento.
Un altro metodo è lamicroiniezione: l'inserimento del materiale tramite un sottile ago direttamente nella cellula. Per ovvi motivi pratici è più frequentemente usato in clinica, in tecniche come lafecondazione artificiale, che non in laboratorio dove si lavora con un alto numero di cellule.
Un approccio diretto alla trasfezione è poi il metodo cosiddetto delcannone genico dove il DNA è accoppiato a un solido inerte (di solito perline dioro) che è "sparato" direttamente nella cellula.
Il DNA può infine essere inserito tramitetrasduzione, trasportato quindi da unvirus. Sono usati principalmenteadenovirus,retrovirus elentivirus.
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