Orellana prese parte allaconquista del Perù conFrancisco Pizarro, e fu il comandante in seconda diGonzalo Pizarro durante la sua spedizione del1541 ad est diQuito nelSud America interno alla ricerca diEl Dorado. La spedizione superò leAnde e incontrò le propaggini che davano sull'immensa foresta delRio delle Amazzoni. Arrivati ad un fiume navigabile, la spedizione si fermò e Gonzalo Pizarro mandò in avanscoperta parte della spedizione al comando di Francisco Orellana lungo il fiume alla ricerca di cibo che cominciava a scarseggiare.
Dopo aver atteso inutilmente il suo ritorno, da un fuggitivo della spedizione di Orellana si venne a sapere che Orellana aveva deciso di costruire delle imbarcazioni, imbarcarvi i suoi uomini, e seguire il corso del fiume sconosciuto verso il mare (non sapendo che avrebbe dovuto percorrere migliaia di km). Così, nel dicembre del 1541, mentreGonzalo Pizarro guidava i suoi uomini in una terribile marcia di ritorno verso Quito, Orellana proseguì con i suoi uomini discendendo il corso delRio Coca con le rustiche imbarcazioni che aveva costruito e con le quali seguì il corso della corrente fino alla confluenza del Rio Coca con l'Aguarico.
Quindi la spedizione giunse presso ilRio Napo e poi entrò in un enorme fiume, che veniva chiamatoMarañon dai nativi. In questa spedizione, Orellana fu accompagnato dal religiosoGaspar de Carvajal, che scrisse una relazione del viaggio chiamata: '"Relacion del nuevo descubrimento del famoso Rio Grande que descubrió por muy gran ventura el Capitan Francisco de Orellana". In quello che fu uno dei più affascinanti viaggi che la storia conosca, Orellana percorse, navigando, l'interoRio delle Amazzoni, arrivando al suo estuario nell'agosto del1542. I superstiti costeggiarono l'America del Sud verso Nord attraverso l'oceano Atlantico fino all'isola di Cubagua inVenezuela.
Orellana diede nome al fiume Rio delle Amazzoni (inspagnoloRio Amazonas) in quanto, lungo esso, fu attaccato da un gruppo di donne indigene combattenti, come leAmazzoni della mitologia greca.
La mitica città diEl Dorado non fu trovata, ma Orellana contribuì a far conoscere inEuropa uno dei territori più inesplorati del mondo. Di ritorno inSpagna, cercò l'appoggio diCarlo V per organizzare una nuova spedizione. Dopo qualche anno riuscì a ripartire al comando di quattro navi con l'idea di fondare una città alla foce del grande fiume e con il titolo di Governatore dell'Amazzonia, che veniva chiamata Nuova Andalucia ed era sotto l'influenza spagnola.
La partenza avvenne nel 1545, ma questa volta la spedizione non ebbe l'esito sperato. Innanzitutto tre navi si persero prima di giungere all'estuario delRio delle Amazzoni, ed inoltre i rimanenti superstiti furono facile preda di malattie e di continui attacchi indigeni. Orellana morì a causa di una malattia fulminante (malaria cerebrale) e i sopravvissuti ripararono con una nave di fortuna nell'isola Margarita in Venezuela.
In vari racconti redatti dal fumettista Hugo Pratt, Orellana viene spesso nominato in Corto Maltese nelle sue avventure in sud America alla ricerca delle sette città di Cibola.
Nella storia diZagorLe donne guerriere (2012) viene narrata in unflashback iniziale la spedizione di Orellana.