Setelah berhenti menjadi model dan pada sejak dia masih kecil berusia 4 tahun, Ackles mulai berkonsentrasi pada karier yang akting pada tahun 1996. Ia tampil dalam beberapa peran tamu diMr. Rhodes,Sweet Valley High, danCybill sebelum bergabung dalam tokohopera sabunNBC,Days of Our Lives sebagai Eric Brady tahun 1997. Ia menjuaraiSoap Opera Digest Award tahun 1998 untuk Pria Pendatang Terbaik dan berlanjut lagi untuk dinominasikan tiga kali (tahun 1998, 1999, dan 2000) untukDaytime Emmy Award sebagaiAktor Muda Terkemuka dalam Serial Drama dalam perannya diDays of Our Lives.[7]
Ackles mengawaliDays of Our Lives pada tahun 2000 dan melanjutkan lagi tampil dalam serial miniBlonde tentang kehidupanMarilyn Monroe. Ia juga mengikuti audisi untuk peran sebagai ramajaClark Kent dalamSmallville, tetapi peran itu ditawarkan untuk pengganti aktorTom Welling.[8] Setelah mendapatkan bagian, dia tampil dalam peran tamu dalam serial televisiJames Cameron,Dark Angel padaFox tahun 2001 sebagai Ben/X5-493, si psikopatik, pambunuh berantai "saudara" karakter utama Max/X5-452 (diperankanJessica Alba). Karakternya tewas dalam episode, tetapi Ackles kembali tampil sebagai pemain tetap serial di musim kedua sebagai saudara kembar Ben, Alec/X5-494. Dia tetap dengan pertunjukan hingga pembatalannya pada tahun 2002.
Ackles berusaha keras sepanjang 2003. Dia bergabung menjadi tokoh acara utamaWBDawson's Creek sepanjang akhir musim, memerankan CJ, orang yang menyukaiJen Lindley. Setelah itu, Ackles bermain beberapa episode serial filmStill Live yang tidak tampilkan untuk Fox sebelum akhirnya dihentikan dengan kasar. Dia juga memiliki peran kecil dalam film singkat tahun 2004The Plight of Clownana. Ackles menjadi pilihan pertama produser untuk memerankan orang yang menyukaiEliza Dushku pada musim keduaTru Callong,[9] namun Ackles kembali keVancouver (dimanaDark Angel difilmkan) tahun 2004 untuk menjadi pemain tetap dalamSmallville sebagai pengganti, yang memerankanJason Teague, orang yang mencintaiLana Lang, diperankanKristin Kreuk. Dia juga memiliki peran utama dalam film tahun 2005Devour, dimana ayahnya juga mendapatkan peran.
Ackles kemudian juga bermain di film laris'Supernatural'. Film ini dianggap menjadi film tersukses Ackles dilihat mulai dari jumlah penggemar yang melunjak sampai kematangan akting yang semakin terasah. Pria tampan ini bermain sebagai Dean Winchester yang memulai petualangannya dengan adiknya Samuel (Sam) Winchester yang dimainkan oleh Jared Padalecki. Cerita dimulai saat mereka menyadari adanya keanehan dengan kematian ibu mereka 22 tahun yang lalu saat Sam masih bayi. Sementara itu, Sam mulai merasa ada yang aneh pada dirinya di mana dia bisa merasakan hawa hantu dan yang lain. perjalanan mereka keliling Amerika menaiki mobil hitam Chevy impala ini sangat menarik dan banyak membuat orang kagum, terlebih saaat akting mereka dipenuhi dengan akting Jeffrey dean Morgan yang berperan sebagai John Winchester, ayah mereka. Supernatural sukses menyihir ribuan penggemarnya karena kehadiran Jensen Ackles sebagai Dean yang penuh perhatian tetapi keren. Produksi film ini terus berlanjut dan mengusung tema baru lagi yaitu kematian Ackles di season 3 seiring dengan terus naiknya jumlah penggemar mereka. ('.[10]
Ackles adalah mulai muncul dalam film 2007Ten Inch Hero, dimana ia akan berperan seperti pendeta. Ia juga tampil di atas pentas dari tanggal 5-10 Juni 2007 denganLou Diamond Phillips dalamA Few Good Men yang merupakan suatu Teater Casa Mañana diFort Worth Texas sebagai Lt. Daniel Kaffee.Ini menandakan pertama kalinya Jensen Ackles telah tampil dalam bidang teater hidup di luar sekolah tinggi.
Jensen Ackles dan keluarganya juga membuat sebuah usaha pembuatan bir, Family Business Brewing Co. di Dripping Springs, Texas, Austin, Amerika Serikat. Selain Jensen, istrinya, Danneel Harris, Kakak ipar laki-lakinya, Gino Groul, kepala pembuat bir, Nate Seale, dan orang tuanya ikut terlibat dengan usaha ini. Lahan seluas 15 hektar mencakup ruang produksi bir dan ruang minum, serta fitur ramah keluarga seperti taman bermain, area musik live, dan ruang untuk truk makanan. Family Business Brewing Co akan di buka pada tahun 2018.
