Transmisijski elektronski mikroskop.Peludi snimljeni skenirajućim elektronskim mikroskopom.Elektronski mikroskop koji je konstruiraoErnst Ruska 1933.Uzročnikmalarije (plasmodium) snimljen transmisijskim elektronskim mikroskopom.Snimkamrava snimljena skenirajućim elektronskim mikroskopom.Leguraaluminija s 4%bakra, amikrostruktura pokazuje taloženje bakra (tamni dijelovi) unutar osnove aluminija.
Elektronski mikroskop jeuređaj kojim se, s pomoću uskog snopaelektrona, dobiva uvid umikrostrukturu promatranog uzorka, uz golemopovećanje. Najviše su u upotrebi transmisijski i skenirajući elektronski mikroskopi. Primjena elektronskoga mikroskopa vrlo je široka. Poznavanje strukturečvrstih tvari, o kojoj ovise njihova svojstva, može riješiti mnoge problemekemije,fizike,metalurgije,mineralogije,geologije ibiologije. Nizom elektronskomikroskopskih snimaka moguće je pratiti pojedinefaze različitih procesa, kao na primjer proces razvijanja ufotografiji i proceskatalize, istraživanjem strukture vlakana razjašnjavaju se makroskopska svojstvatkiva, a mogućnost promatranja svijetabakterija ivirusa, makromolekula,stanica i mnogih pojedinosti strukture organizma proširuje područje istraživanja biologije imedicine.[1]
Međutim, za biološke uzorke stvarna granica razlučivosti obično nije niža od 2 nm ili je viša, zbog problema s pripremom preparata ikontrastom. Elektronski mikroskop ima oko 100 puta veću moć razlučivanja od svjetlosnog mikroskopa. Za posljedicu je i iskoristivo povećanje također veće: do 100 000 puta elektronskog mikroskopa, u usporedbi s 1000 do 1500 puta kod svjetlosnog mikroskopa. Na taj je način, promatrajući ju elektronskim umjesto svjetlosnim mikroskopom, moguće zapaziti mnogo više detalja u građistanice.
S optičkimmikroskopom koji se osniva na običnojsvjetlosti ne mogu se vidjeti predmeti čija je duljina manja odvalne duljine upotrijebljene svjetlosti. Pri tom povećanje optičke leće može biti bilo kako veliko, ali mi predmet ipak ne možemo vidjeti. Dakle, rastvorna snaga (razlučivost) optičkog mikroskopa ograničena je valnom duljinom svjetlosti. Rastvorna snaga mikroskopa je najmanji razmak između dviju čestica, od kojihobjektiv mikroskopa daje za svaku posebnu sliku tako da se ne slijevaju zajedno. Ova je činjenica dala osnovu da sekatodne zrake, to jest rojelektrona koji je znatno manje valne duljine, upotrijebi za izgradnju elektronskog mikroskopa. Pokusi su naime pokazali da se elektroni određene brzine odnosno energije vladaju kao valovi određene valne duljine, te da moguinterferirati. Također se pokazalo da se svi elektroni koji izlaze iz jedne točke, a prolaze uzduž jedneelektrične zavojnice, opet sastaju u jednoj točki. Ta činjenice je omogućila stvaranje elektronske optike.Elektronska optika sastoji se od elektronske leće koje mogu biti magnetske i elektrostatske. U donjem dijelu leće silnice se razilaze odosi, pa bi ovdje trebalo da nastanedivergencija elektronskog snopa. Budući da sada elektroni imaju veću brzinu zbog prijeđenog električnog napona od 4 000V, njihovo je rasturanje od osi manje. Drugim riječima, nastaje konvergencija elektronskih zraka, pa elektrostatska leća djeluje kao sabirna leća.
Prema vrsti leća razlikujemo uglavnom magnetske i elektrostatske mikroskope. Kod elektronskog mikroskopa s magnetskim lećama kao izvor svjetlosti upotrebljava sekatodna cijev, pa se elektronski snop koncentrira na predmet pomoću prve magnetske leće. Druga magnetska leća daje uvećanu sliku predmeta koju ponovo povećava treća magnetska ili projektorska leća. Pritom put, kojim prolaze elektroni mora bitivakuum.Tlak u mikroskopu iznosi oko 10-6bara. Slika predmeta se dobije nafluorescentnom zastoru ili nafotografskoj ploči.Snaga elektronskog mikroskopa, to jest njegova rastvorna moć ovisi o primijenjenomelektričnom naponu koji obično iznosi od 20 do 50 kV.
To znači da je zapravo povećanje elektronskog mikroskopa neograničeno. Potrebno je samo povećati brzinu elektrona, to jest skratiti njihovu valnu duljinu. To se pak postiže povećanjem napona između katode i anode u izvoru elektrona. Danas se grade elektronski mikroskopi za povećanje i preko 30 000 puta.[2]
Magnetska leća se sastoji odelektrične zavojnice sa stanovitim brojem zavoja kroz koje protječe električna struja određene jakosti. O dimenzijama ove zavojnice, njezinom obliku i broju zavoja ovisižarišna duljina. Kroz zavojnicu prolazi snop divergentnih zraka iz izvora A. Elektroni će zbog djelovanja magnetskog polja na električni vodič opisivati zavojitu stazu koja će se savijati sve više prema osi magnetske leće. Zbog toga nastaje fokusiranje, pa se u točki B dobiva slika izvora A. Zbog toga nastaje fokusiranje, pa se u točki B dobiva slika izvora A. Odatle vidimo da i magnetska leća ima svojstva sabirne leće.
Elektronske mikroskope nalazimo u dva osnovna oblika: transmisijski elektronski mikroskop (TEM) i skenirajući (rasterski) elektronski mikroskop (SEM). Transmisijski i skenirajući elektronski mikroskopi su slični po tome što oba primjenjuju zraku elektrona, no za stvaranje slike koriste posve različite mehanizme. Kao što samo ime govori, TEM sliku oblikuje pomoću elektrona koji se odašilju krozpreparat. SEM, pak, skenira površinu preparata te sliku oblikuje otkrivajući elektrone koji se odbijaju od vanjske površine preparata. Skenirajuća elektronska mikroskopija je napose neobična tehnika zbog dojma dubine koji se stječe promatranjem prikazanih bioloških struktura.
Zbog niske prodorne snage elektrona, uzorci koji se pripremaju za elektronsko mikroskopiranje moraju biti iznimno tanki. Sprava koja se koristi za tu svrhu naziva se ultramikrotom. Opremljena jedijamantnim nožićem te može rezati presjeke debljine do 20 nm. Postojeći deblji pripravci se također mogu promatrati elektronskim mikroskopom, ali je u tom slučaju potreban znatno veći pogonski napon kako bi se primjereno povećala prodorna snaga elektrona. Takav visokonaponski elektronski mikroskop koristi pogonskinapon od nekoliko tisuća kilovolta (kV), što je jedva usporedivo s rasponom od 50– 100 kV koliko je potrebno većini konvencionalnihinstrumenata. Presjeci do 1μm debljine se mogu proučavati isključivo s takvim visokonaponskim instrumentima. Tolika debljina nam omogućava detaljnije istraživanjeorganela i drugih staničnih struktura.
Transmisijski elektronski mikroskop rabi se za promatranje uzoraka koji su za elektrone propusni, pa zato debljina uzoraka rijetko može biti veća od 1 μm. Po građi je sličan optičkomumikroskopu, ali radi u uvjetima visokogavakuuma. Kao izvor elektronskoga snopa služi elektronski top. Njega čini katoda, običnovolframska nit, koja zagrijavanjem emitira elektrone (termionska emisija), Wehneltov cilindar za fokusiranje elektronskoga snopa teanoda s velikom razlikompotencijala premakatodi. Zbog te se razlike elektroni snažno ubrzavaju i njihov se snop prvom elektronskom lećom, koja ima ulogu kondenzora, usmjerava na uzorak (elektronska optika). Prolaskom kroz uzorak elektroni se u susretu satomima raspršuju razmjerno debljini i gustoći područja na koje nailaze. Preostali, neraspršeni elektroni čine elektronsku sliku uzorka, koja se povećava sustavom elektronskih leća (leća objektiva, međuleća, projektorska leća). Konačna slika nastaje nafluorescentnom zaslonu, a njezini tamni dijelovi odgovaraju debljim i gušćim područjima uzorka. Kvaliteta slike ovisi o vrsti kontrasta, koji može biti ogibni ili fazni. U ogibnome kontrastu postoje slike svijetlog i tamnog polja, koje imaju inverzan kontrast, a povezane su sogibnom slikom istog područja promatranoga na mikrografiji. Iz ogibne se slike prepoznajesimetrija promatranog uzorka, a smjerovi iz ogibne slike izravno se prenose u elektronsku sliku svijetloga polja, tamnog polja ili u sliku visokog razlučivanja koja se temelji na faznome kontrastu. Na temelju ogibne slike moguće je odreditikristalnu strukturu. Međutim, kvantitativna informacija o mikrostrukturi materijala može se dobiti detaljnom korelacijom ogibne i elektronske slike. Ogibni kontrast oslikava detalje veće od 1,5 nm, a fazni kontrast daje razlučivanje na razini atoma. Kako elektronski snop putuje u vakuumu, posebni uređaji omogućuju izmjenu uzoraka bez prisutnosti zraka.
Transmisijski elektronski mikroskop svojim velikim korisnim povećanjem i sposobnošću razlučivanja znatno nadmašuje mogućnosti optičkoga mikroskopa, jer jevalna duljina elektronskoga zračenja mnogo manja od valne duljinesvjetlosti. Naime, maksimalna razlučivost mikroskopa (najmanja udaljenost dviju točaka na kojoj ih je moguće razlikovati) ograničena je valnom duljinom zračenja koje prolazi kroz uzorak, a odabirom zračenja manjih valnih duljina postiže se boljarazlučivost. Današnja se granica razlučivanja najsnažnijih transmisijskih elektronskih mikroskopa približava iznosu od 0,1 nm uz povećanje slike od 1,5 milijuna puta, a to je dovoljno za istraživanjemolekularne strukture, pa i za raspoznavanjeatoma ukristalima.
Skenirajući ili rasterski elektronski mikroskop služi za proučavanjereljefa površine uzoraka, koji mogu biti i masivni, za elektrone nepropusni, a njime se može vrlo dobro oslikati trodimenzionalnost uzorka. Sustavom elektronskih kondenzorskih leća elektroni se fokusiraju (žarište) u vrlo uzak snop, koji se otklonskim elektronskim lećama usmjerava na površinu uzorka i tako ju, točku po točku, pretražuje u oblikurastera. Djelovanje snopa na površinu uzrokuje emisiju sekundarnih elektrona, koje je u emisijskom načinu rada moguće registrirati kao sliku na zaslonukatodne cijevi. S obzirom na način zapisivanjasignala koji nastaju interakcijom elektronskoga snopa i površine razlikuju se refleksijski, apsorpcijski, transmisijski, rendgenski i katodoluminiscentni način rada.
U elektronskoj je mikroskopiji razvijeno više specifičnihtehnika, od kojih je uistinu svaka tek drugačiji način pripremanja uzorka za transmisijsko elektronsko mikroskopiranje. Ovdje navodimo samo neke.
Tehnikomnegativnog bojenja se uzorci ne režu na ultratanke prereze već se mjesto toga jednostavno odlažu u gustu elektronsku boju, omogućavajući netaknutom preparatu da sliku tvori izdvajajući se od tamno obojene pozadine. Ova je tehnika očigledno primjenjiva isključivo na vrlo male predmete poputvirusa ili izoliranih organela, ali omogućava da se izgled oblika i površine proučava na još uvijek netaknutim predmetima.
Frakturiranje zamrzavanjem uključuje načelno različite načine pripreme uzorka. Umjesto rezanja ravnomjernih presjeka ili proučavanja cjelovitog materijala, preparati se podvrgavju naglom zamrzavanju – obično u tekućemdušiku – a onda se udaraju oštrim rubom sječiva. Ovo uzrokuje lomljenje (frakturu) preparata po linijama prirodne slabosti, što su u većini slučajeva prazni prostori umembranama. Tanki slojmetala sa zgusnutim elektronima, poputzlata iliplatine se tehnikom "zasjenjivanja" nanosi na površinu uzorka stvarajući kopiju preparata od zlata ili platine. Kopija se potom proučava TEM-om. Iz razloga što linija loma prolazi kroz prazne prostore u membranama gdje god je to moguće, kopija nastala ovim postupkom je vjeran prikaz unutrašnjosti membrana. Proučavanje uzoraka frakturiranja zamrzavanjem je u velikoj mjeri pridonijelo našem razumijevanju građe membrana.
Elektronska mikroskopija je, ostvarujući detaljna ultrastrukturna istraživanja, iz temelja preinačila naše razumijevanje građestanice. Neki seorganeli (poputjezgre ilimitohondrija) dovoljno dobro vide i korištenjemsvjetlosnog mikroskopa, ali se uz pomoć elektronskog mikroskopa mogu vršiti mnogo detaljnija istraživanja. Pored toga, elektronska mikroskopija je otkrila stanične strukture koje su premalene da bi se mogle zamijetiti svjetlosnim mikroskopom. One uključujuribosome,membrane,mikrotubule, imikrofilamente.
