OmicroARN oumiARN[1] (en inglésmiRNA) é unARN monocatenario, dunha lonxitude de entre 21 e 25nucleótidos, que ten a capacidade de regular a expresión dexenes por medio de diversos procesos, utilizando a ruta dainterferencia de ARN (RNAi).[2]
Foron descritos inicialmente en 1993 por Lee e colaboradores no laboratorio deVictor Ambros,[3] pero o termo "microRNA" (sic) non se acuñou ata 2001, ano en que apareceu nun conxunto de tres artigos publicados enScience (26 de outubro de 2001).[4] A principios de 2008, certas análises computacionais realizadas porIBM suxerían a presenza de arredor de 50.000 miARN diferentes noxenoma humano, cada un talvez con miles de dianas deARNm potenciais (despois non se atoparon tantos).[5]Victor Ambros eGary Ruvkun obtiveron oNobel de Medicina en2024 pola súa descuberta do microARN.
Unha vez descubertos osARN interferentes pequenos (siRNA) e a existencia nascélulas deproteínas quecatalizan a degradación doARNm, os investigadores preguntáronse se os siRNA tamén estaban codificados no xenoma, e empezaron a purificar pequenos ARN (de 19-25 nucleótidos) en diferentes especies animais. Porén, non encontraron siRNA, senón os denominados microARN, que se identificaran anteriormente de forma independente.[3]
Os miARN son moléculas de ARNtranscritas a partir de xenes deADN, pero non sontraducidas aproteínas. Exprésanse nunha ampla variedade de organismos, desdeplantas atavermes ehumanos. As secuencias de moitos miARN están ben conservadas entre especies,[7] e moitos compoñentes da maquinaria dos miARN se encontraron mesmo nasArchaea eeubacterias, o que revela que a súa orixe é moi antiga. Algúns recontos de miARN en humanos identificaban ata 800, o que implicaría que os miARN poderían representar como mínimo o 3% de todos os xenes humanos.[8]
Asecuencia de ADN que codifica un xene de miARN ten unha lonxitude que supera o tamaño final do propio miARN e inclúe a rexión miARN e unha rexión que écomplementaria á anterior, o que permite o seu emparellamento porpontes de hidróxeno. Isto comporta que, durante atranscrición desta secuencia de ADN, se forman rexións que teñen a capacidade de formar unha forquita e xerar un ARN bicatenario primario longo coñecido comopri-miARN. Posteriormente, unencima nuclear chamadodrosha corta as bases da forquita, formando o que se denominapre-miARN. Este pre-miARN é transportado desde onúcleo aocitoplasma pola proteínaexportina 5. Unha vez que o pre-miRNA está no citoplasma é fragmentado polo encimaDicer, que o corta ata a lonxitude final de 20-25nucleótidos.[6]
A función dos miARN está relacionada coaregulación da expresión xénica. Un miARN é complementario dunha parte dun ou máis ARN mensaxeiros (ARNm). Os miARN de animais adoitan mostrar complementariedade imperfecta coa rexión 3'UTR, e xeralmente inhiben a tradución do ARNm, entanto que os das plantas adoitan mostrar complementariedade perfecta con rexións codificantes e inducen o corte e a posterior degradación do ARNm diana (como acontece cossiRNA en animais).[6]
Antes de clasificalos como parte da vía daRNAi, os miARN foron identificados inicialmente en vermes, nos que regulan as fases do desenvolvemento,[9] pero actualmente sabemos que están implicados nunha ampla variedade de procesos do desenvolvemento e poderían ter unha función no establecemento de redes e no axuste fino da expresión xénica na célula.[7][10] Dado que o número de dianas potenciais dos miARN é de miles (arredor do 30% dos xenes humanos), os miARN poderían constituír outro nivel máis do circuíto regulatorio que existe nas células.[11] Isto implica que calquera desregulación dos miARN podería supoñer grandes problemas regulatorios na célula, inducindo quizaisfenotipos cancerosos. De feito, demostrouse que os perfís de expresión dos miARN están modificados nun gran número de tipos de cáncer[12] e que a sobreexpresión forzada dos miARN podería conducir ao desenvolvemento de tumores.[13]
Os miRNA transcríbense en diferentes localizacións doxenoma como longos transcritos primarios (pri-miRNA) polaARN polimerase II.[14]
Os miARN poden atoparse en moitos tipos deloci noxenoma:[15]
Aproximadamente o 50% dos miARN están enclusters de miARN que están inicialmente codificados como un transcritopolicistrónico (que inclúe varios xenes),[17] que posteriormente se fragmenta en múltiples miARN. Na maioría dos casos, os miARN policistrónicos comparten o mesmo patrón de expresión. Porén, os niveis relativos dos miRNA dentro do clúster parecen estar regulados dunha maneira dependiente do desenvolvemento e ahomeostase, o que suxire unha complexidade aínda non definida na regulación da expresión xénica.
Os xenes que codifican miARN son moito máis longos cós miARN procesados maduros; os miARN transcríbense inicialmente como transcritos primarios ou pri-miARN cunha gorra ou carapucha noextremo 5' e unhacola de poli-adeninas (poli-A) no3' e procésanse nonúcleo celular en estruturas curtas de 70nucleótidos en forma detalo-lazo (stem-loop) coñecidas como pre-miARN. En animais esteprocesamento realízase por uncomplexo proteico chamado Microprocesador, que consta danucleaseDrosha[18] e a proteína de unión a ARN dedobre hélicePasha.[19][20] Estes pre-miARN son logo procesados a miARN maduros nocitoplasma por medio da interacción coa endonucleaseDicer, que tamén inicia a formación do complexo RISC (RNA-induced silencing complex,complexo silenciador inducido por ARN).[21] Este complexo é o responsable do silenciamento de xenes que se observa debido á expresión dos miARN e áinterferencia de ARN mediada porsiRNAs. A vía varía lixeiramente en plantas, debido a que carecen de homólogos deDrosha; no seu lugar son só homólogos de Dicer os que realizan algúns dos pasos do procesamento.[22] A vía tamén é diferente para os miARN derivados de talos-lazos (stem-loops) procedentes de secuenciasintrónicas; neste caso procésanse por Dicer pero non por Drosha.[23] Tanto a fibra consentido coma a antisentido do ADN poden funcionar como molde para producir miARN.[24]
Drosha[25] (RNASEN en humanos)[26] é unha proteína nuclear dun tamaño entre 130 e 160 kDa (quiloDalton). Contén osdominios seguintes:
Drosha funciona nun complexo (o Microprocesador), conxuntamente cunha proteína de unión ao ARN (denominadaPasha enDrosophila ouDGCR8 en mamíferos).DGCR8[27][28] é unha proteína de unión ao ADN que recoñece a zona de unión entre o ARN de dobre cadea e o monocatenario e sitúa aribonuclease Drosha a unha distancia de 11nucleótidos (que corresponde a unha volta de hélice) desde a zona de unión. Por tanto, a función de DGCR8 no complexo Microprocesador é análoga ao dominio PAZ deDicer; DGCR8 proporciona especificidade desubstrato e sitúa axeitadamente o centro daribonuclease Drosha. Porén, no caso de Drosha-DGCR8, o dominio de especificidade está localizado nunha cadea polipeptídica separada dos dominiosARNase III. Propúxose que o dominio WW de unión aprolinas de DGCR8 interacciona co extremo N-terminal de Drosha, rico en prolinas. É posible que Drosha teña outras posibles proteínas asociadas que presenten dominios WW que lle dean especificidades de substrato alternativas e funcións biolóxicas adicionais de Drosha.
O procesamento eficiente dos pre-miARN por Drosha require da presenza de longas colas de ARN de fibra simple tanto noextremo 3' coma no5' da molécula en forquita.[29] Estes motivos que presenta o ARN de fibra simple poden variar en composición, pero a súa lonxitude é de grande importancia para que o procesamento teña lugar. Unha análisebioinformática de pri-miARN en humanos e moscas identificou rexións estruturais similares, denominadas "segmentos basais" (basal segments), "talos inferiores" (lower stems), "talos superiores" (upper stems) e "lazos terminais" (terminal loops); baseándose nestas estruturas conservadas, determináronse perfístermodinámicos dos pri-miARN.[30] O complexo de Drosha (o Microprocesador) corta a molécula de ARN aproximadamente dúas voltas de hélice a partir do lazo terminal e aproximadamente unha volta de hélice a partir dos segmentos basais. Na maioría das moléculas analizadas esta rexión conténnucleótidos non emparellados con outros e a enerxía libre do dúplex é relativamente alta en comparación coas rexións "talo superior" e "talo inferior". A maior parte dos pre-miARN non presentan unha estrutura de ARN de dobre fibra perfecta cun lazo terminal final. Existen algunhas explicacións posibles para esta selectividade. Unha podería ser que os ARN de dobre fibra que teñen unha lonxitude maior de 21pares de bases activan a resposta deinterferón e a maquinaria antiviral da célula. Outra explicación aceptable podería ser que o perfil termodinámico do pre-miARN determina cal será a fibra incorporada no complexo Dicer. De feito, detectáronse claras similitudes entre pri-miARN codificados tanto en fibras 5' coma 3'.[30]
Unha vez xerado o pre-miARN,Dicer corta otalo-lazo (stem-loop) e fórmanse dúas moléculas complementarias curtas, pero só unha se integra no complexoRISC (aantisentido), como ocorre cossiRNAs. Esta fibra coñécese como afibra guía, que é seleccionada pola proteína Argonauta, aARNase cataliticamente activa no complexo RISC, en función da estabilidade doextremo 5'.[31] A outra fibra (a con sentido), coñecida comoanti-guía oufibra pasaxeira, é degradada polo complexo RISC.[32] Despois da súa integración no complexo RISC, agora activado, os miARN emparéllanse de acordo coa súasecuencia de bases coa molécula deARNm complementaria, e en animais, a diferenza co que pasa cos siRNA, na maioría dos casos inducen a inhibición da tradución de dito ARNm.
Porén, malia que Dicer é un encima fundamental no procesamento dos microARN, identificouse unha vía de bioxénese de miARN independente de Dicer que utiliza a actividade catalítica de corte de Argonauta2 (Ago2). Así, a diferenz doutros miARN, os niveis dalgúns miARN (miR-451-5', miR-2190-5', miR-2190-3', e miR-735-5') non se alteran enmutantes con perda de función de Dicer, pero diminúen en mutantes MZago2 (maternal-zygotic). No caso de miR-451 (un miARN implicado na diferenciación daliña eritroide[33]), o procesamento de pre-miR-451 require a actividade catalítica de Ago2in vivo. Os mutantes MZago2 mostran un atraso naeritropoese que pode recuperarse utilizando Ago2 detipo salvaxe ou con dúplex de miR-451, pero non con Ago2 cataliticamente inactiva. Por iso, suxeriuse que Ago2 pode xerar miARN funcionais independentemente de Dicer.[34] Resultados similares observáronse en organismos diferentes.[35]
Como se indica no caso dos siRNA, aínda non está claro como o complexo RISC activado localiza os ARNm complementarios no interior celular. As proteínas Argonauta, os compoñentes catalíticos de RISC, están localizadas en rexións específicas docitoplasma denominadascorpos P (tamén corpos citoplásmicos ou corpos GW, porque conteñen a proteína GW182), os cales son rexións con altas taxas de degradación de ARNm;[36] tamén se detectou actividade miARN nos corpos P.[37] A alteración dos corpos P diminúe a eficiencia do proceso de RNAi (interferencia), o que suxire que os corpos P poderían ser un lugar crítico para o proceso de RNAi.[38] Non obstante, estudos posteriores demostraron que os corpos P non son imprescindibles para o proceso de RNAi, xa que células sencorpos P poden producir silenciamento tanto con siRNA coma con miARN.[39]
Malia o importante progreso realizado na comprensión da bioxénese e a función dos miARN, os mecanismos utilizados polos miARN para regularen a expresión xénica seguen debaténdose intensamente.[40] Existen traballos publicados que indican que os miARN en células animaisreprimen a expresión xénica de catro formas diferentes:
Ademais, os miARN en animais poden inducir unha degradación significativa dos ARNm diana (como fan os miARN de plantas), a pesar do emparellamento de bases imperfecto ARNm-miARN. Porén, o mecanismo de degradación adoita ser diferente: os miARN inducen a degradación dos ARNm diana por medio da eliminación da carapucha (no extremo 5') e dacola de poliadeninas (poli-A, no extremo 3').[41] Finalmente, os microARN poderían tamén silenciar os seus ARNm dianas secuestrándoos en puntos citoplásmicos discretos, os cales serían os corpos de procesamento de ARNm ou corpos P, que carecen de maquinaria de tradución. Porén, a pesar das discrepancias existentes entre os diferentes mecanismos propostos, os apoios experimentais para cada mecanismo son variados, e son obxecto actualmente de intensos estudos, para tratar de aclaralas. Suxeriuse que as diferenzas observadas se deben a deficiencias nos experimentos realizados, nalgúns casos orixinadas pola utilización de modelos errados nos estudos de regulación da tradución.[42]
Por último, en estudos recentes detectouse que en determinadas condicións, os miARN poden taménactivar a síntese proteica.[43]
Características xerais do funcionamento dos miARN:[40]
Os miARN poden funcionar comosupresores de tumores ou comooncoxenes; queda por demostrar a súa influencia concreta en cada tipo decáncer.[52] De feito, un estudo mostrou que preto do 50% dos miARN en humanos están localizados en áreas doxenoma coñecidas comositios fráxiles,[53] que están asociadas co desenvolvemento decáncer.
A expresión de certos miARN está correlacionada con varios tipos de cáncer, polo que funcionarían comooncoxenes. Por exemplo, un informe de Sonoki e colaboradores[54] relacionou o xenemir-125b-1 conleucemia, e describiu un paciente con leucemia linfoblástica aguda de precursores decélulas B que portaba unha inserción do pre-miARN nolocus dacadea pesada dainmunoglobulina. Aínda que os investigadores non puideron determinar como se modulaba a expresión de mir-125b-1 nas células tumorais, este estudo apoia o papel deste xene como unoncomir.
A primeira indicación de que os miARN poderían funcionar comosupresores detumores procede dun informe de Calin e colaboradores[55] que mostraba que pacientes diagnosticados cunha forma frecuente deleucemia en adultos (leucemia linfoide crónica dascélulas B ouLLC), presentan a miúdodelecións ou sub-regulación (downregulation) de dous xenes de miARN presentes nunclúster,mir-15a emir-16-1. Aparecen delecións dentro dolocus 13q14 en máis do 65% dos casos de LLC, e en máis do 50% doslinfomas das células do manto, o 16–40% dosmielomas múltiples e o 60% dos cánceres depróstata. Por tanto, propúxose que un xene supresor detumores debía residir nesta rexión de 30-kb. É interesante notar que mir-15a e mir-16-1 mapean dentro dointrón dun xene deARN non codificante de proteína, de función descoñecida, denominado LEU2. Por outro lado, alguúns estudos establecen unha conexión entre a redución da expresión delet-7 (que regula a proliferación ediferenciación celular enCaenorhabditis elegans) e o incremento da xénese de tumores e o prognóstico grave dos doentes afectados.[56] Ademais, durante o desenvolvemento normal, LIN28 (un promotor de pluripotencia) pode previr a acumulación de let-7. De acordo con estes resultados, propúxose que let-7 regularía a capacidade pluripotente (stemness) das células, reprimindo a auto-renovación e promovendo a diferenciación, tanto durante o desenvolvemento normal coma no cáncer.
Por outro lado, observouse ademais que os microARN contribúen á progresión maligna do cáncer, especificamente mediando ainvasión tumoral e a formación demetástases.[57]
Por exemplo, enCaenorhabditis elegans, os miARN permiten un paso rápido a través das diferentes fases do desenvolvemento:[58] os miARN lin-4[59] e let-7[60] controlan o momento no que se define o destino das célulasneuronais e hipodérmicas durante o desenvolvemento larvario.[61] lin-4, let-7 e outros xenes de miARN están consevados en mamíferos, e a súa función potencial nodesenvolvemento embrionario de mamíferos estase a estudar activamente. EnC. elegans, os niveis de expresión de LIN-14[62] e LIN-28[63] diminúen debido á expresión do ARN de lin-4 ao final do primeiro estadio larvario, para permitir a progresión a estadios laravarios posteriores. Nos estadios larvarios finais, a expresión de LIN-41[64] e outros xenes podería verse reducida pola expresión do ARN de let-7, liberando a represión da expresión da proteína LIN-29[65] e permitindo a progresión ao estadio adulto. Dado que o ARNm de lin-29 non posúe sitios complementarios ao ARN de let-7, probablemente lin-29 non é unha diana directa de let-7.
Por outro lado, enmiocitos de mamíferos, a activación do factor de transcrición SRF[66] induce la expresión de miR-1–1[67] e miR-1–2,[68] que á súa vez reprime a expresión do factor de transcrición Hand2[69] e oligando deNotch,[70] Delta, afectando, por tanto, a expansión das células proxenitoras ou a súa diferenciación.[71] SRF tamén induce a expresión de miR-133a-1[72] e miR-133a-2,[73] o que inhibe á súa vez SRF nun bucle de retroalimentación. No músculo opera unha vía similar, agás que a inhibición por retroalimentación deMef2[74] eMyoD[75] acontece cando a expresión deHDAC4[76] está reducida debido ao silenciamento exercido por miR-1–1 e miR-1–2.
Un dos primeiros miARN detectados cunha función no desenvolvemento dosistema inmunitario[51] foi miR-181a;[77] este miARN exprésase en altos niveis nas células dotimo e en niveis menores nas células do corazón, os nódulos linfáticos e amedula ósea. Na medula ósea, miR-181a exprésase en niveis maiores porcélulas B B220+ B ca porcélulas TCD3+. Especificamente, a expresión de miR-181a en células B derivadas da medula ósea diminúe durante a maduración das células B desde o estadio do desenvolvemento de pro-célula-B ao estadio pre-célula-B. Ademais, a expresiónectópica de miR-181a en células enriquecidas encélulas troncais ou nais e proxenitorashematopoéticas orixina un incremento na porcentaxe de células BCD19+ e un descenso na porcentaxe decélulas T CD8+ en ensaios de reconstitución da medula ósea a curto prazo enratos, demostrando que a especificidade de liñas celulares dos miARN podería ter unha función na regulación do desenvolvemento dos linfocitos.
Por outro lado, tamén se detectou unha distribución espacial dos miARN: en embrións dopeixe cebra (Danio rerio), os patróns de localización de miARN individuais indican que a súa actividade podería estar limitada aos tecidos e órganos nos que se expresan. Por exemplo, miR-206[78] exprésase sobre todo no músculo, miR-126[79] nos vasos sanguíneos e ocorazón, miR-200a[80] no sistema daliña lateral (un sistema mecanosensorial que detecta o movemento da auga) e órganos sensoriais, e miR-30c[81] no precursor dosriles.[82]
Dous estudos independentes en 2007 enratos[83][84] indican que os cigotos herdan unha cantidade significativa de miARN maternos, e que ditos miARN maternos poderían ter un papel importante nas fases temperás do desenvolvemento embrionario (efecto materno).
