Enbiologie moléculaire, unmorpholino est un type demolécule utilisé pour modifier l'expression génétique. La technologie desoligonucléotides morpholinos est une technologieantisens utilisée pour bloquer l'accès d'autres molécules aux séquences spécifiques de certaines molécules d'acide nucléique. Ils peuvent bloquer l'accès des autres molécules à de petites régions (environ 25 bases) de la surface d'appariement des bases desacides ribonucléiques (ARN). Les morpholinos sont parfois référencés par l'appellationPMO, un acronyme anglophone signifiantphosphorodiamidate morpholino oligo. Le mot « morpholino » peut apparaître dans d'autres noms chimiques. Il se rapporte à des produits chimiques contenant un cycle à six sous-unités morpholine ; cet article discute seulement des oligonucléotides antisens morpholinos.
En recherche biologique, les morpholinos sont habituellement utilisés en tant qu'outils pour lagénétique inverse parinactivation de la fonction d'un gène. Ceci est accompli en empêchant les cellules de synthétiser uneprotéine[1] ciblée ou en modifiant l'épissage d'unpré-ARNm[2]. L’inactivation de l’expression des gènes est une méthode puissante pour étudier la fonction d’une protéine particulière. Dans le même ordre d’idée, induire l’épissage d’un exon spécifique peut aider à déterminer la fonction de la partie de la protéine codée par cet exon. Ces molécules ont été appliquées à l’étude de plusieurs organismes modèles, incluant lasouris, lepoisson-zèbre et lexénope[3].
Les morpholinos sont également développés en tant que thérapeutiquepharmaceutique dirigée contre les organismespathogènes tels que lesbactéries[4] ou lesvirus[5] et pour l’amélioration des thérapies contre lesmaladies génétiques[6]. Ces oligonucléotides synthétiques ont été conçus par le Dr James E. Summerton (Gene Tools, LLC) et développés en collaboration du Dr Dwight D. Weller (AVI BioPharma Inc.).
Les morpholinos sont desmoléculessynthétiques qui résultent d’un réarrangement de la structure naturelle des acides nucléiques[7]. Habituellement d’une longueur de 25 bases, ils se fixent aux séquences complémentaires des ARN parappariement de bases. Du point de vue de la structure, bien que les morpholinos possèdent des bases azotées classiques, ils diffèrent de l’ADN par le fait que ces bases azotées sont fixées sur des cyclesmorpholines au lieu dedésoxyribose. Ces cycles morpholines sont liés entre eux par des groupements phosphorodiamidate au lieu de groupementsphosphate[7]. Il est plus facile de visualiser ceci en se référant à la figure 1 et en comparant les structures d’un brin d’ARN et d’un brin morpholino. Le remplacement des groupements phosphateanioniques par des groupements phosphorodiamidate non chargés élimine l’ionisation dans la gamme habituelle de pH physiologique, de sorte que les morpholinos dans les organismes ou les cellules sont des molécules non chargées. Le squelette entier d’un morpholino est formé de ces sous-unités modifiées. Les morpholinos sont plus habituellement utilisés sous forme d’oligonucléotides monocaténaires, de sorte que leshétéroduplexes formés à partir d’un brin morpholino et unADN complémentaire peuvent être utilisés en combinaison avec la livraison de réactifscytosoliquecationique[8].
Contrairement à de nombreux types structurels antisens tels que les phosphorothioates ou les petits ARN interférants, les morpholinos ne dégradent pas les molécules d’ARN auxquelles ils se fixent. Les morpholinos agissent par encombrement stérique en se fixant sur leur séquence cible sur un ARN, ils se mettent sur le chemin de molécules qui en leur absence interagissent avec l’ARN[1].
Les oligonucléotides morpholinos sont souvent utilisés pour rechercher le rôle d’un ARNm spécifique transcrit chez l’embryon. Les biologistes du développement injectent les oligonucléotides morpholinos dans les œufs ou les embryons dupoisson zèbre[9], duxénope[10], lepoussin[11] et l’oursin[12] produisant ainsi des embryonsmorphant. Avec un système de transfert cytoplasmique approprié, les morpholinos sont utilisés avec efficacité enculture cellulaire[8],[13].
Les morpholinos sont développés en tant que produit pharmaceutique sous le nom de "NeuGene" par AVI BioPharma Inc. Ils ont été utilisés chez les mammifères allant de lasouris[14] à l’être humain et certains sont couramment expérimentés dans lestests cliniques en tant que thérapie anticancer[15] ou dans le traitement de la myopathie de Duchenne[16].
Chez les organismeseucaryotes, lepré-ARNm esttranscrit dans le noyau, les introns sontépissés, puis l’ARNm mature est exporté dunoyau vers lecytoplasme. Les petites sous-unités duribosome commencent généralement par s’attacher à l’une des extrémités de l’ARNm et y sont rejointes par diversfacteurs d’initiation, formant ainsi le complexe d’initiation. Le complexe d’initiation parcourt le brin d’ARNm jusqu’à ce qu’il rencontre lecodon d’initiation, à ce moment la grande sous-unité du ribosome se fixe à la petite sous-unité. Latraduction de laprotéine débute. Ce processus entier est désigné sous l'appellation d'expression génétique. Il s’agit du processus par lequel l’information d’ungène, codé par la succession des bases azotées dans l’ADN, est converti en une structure protéique. Un morpholino peut modifier l’épissage ou bloquer la traduction selon la séquence en bases du morpholino.
Liés à unerégion non traduite en 5' d’un ARN messager (ARNm), les morpholinos peuvent interférer avec la progression du complexe d’initiationribosomique à partir de lacoiffe en 5’ jusqu’au codon d’initiation. Cetteinactivation de l’expression génétique empêche latraduction de la région codante dutranscrit ciblée. Ceci est utile d’un point de vue expérimental lorsqu’un chercheur souhaite connaître la fonction d’une protéine particulière. Les morpholinos fournissent un moyen commode pour inactiver l’expression de la protéine ciblée et étudier comment l’inactivation change la cellule ou l’organisme. Certains morpholinos inactivent l’expression si efficacement qu’après la dégradation des protéines préexistantes, les protéines ciblées deviennent indétectables parélectrotransfert[17].
Les morpholinos peuvent interférer avec les étapes de maturation dupré-ARNm, soit en empêchant l’accouplement du complexe des petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP) avec leurs cibles au bord des introns sur le brin du pré-ARNm, soit en bloquant les adéninesnucléophiles, prévenant de la sorte la formation d’épissage des structures en lasso ou en interférant avec l’attachement des protéines régulatrices d’épissage telles que les « splice silencers[18] » et les « splice enhancers[19] ». Empêcher l’attachement des snRNP U1 (sur le site donneur) ou U2/U5 (à moitié sur la polypyrimidine et à moitié sur le site accepteur) peut causer des modifications d’épissage, communément l’exclusion d’exons de la maturation de l’ARNm. Cibler certaines cibles d’épissage conduit à l’exclusion de l’intron, tandis que l’activation de sites d’épissage cachés peut conduire à des inclusions ou exclusions partielles[20]. Les cibles des complexes U11/U12 snRNPs peuvent également être bloquées. La modification d'épissage peut être validée par amplification en chaîne par la polymérase après transcription inverse (RT-PCR) et se manifeste, dans ungel d'électrophorèse, par le déplacement de la bande du produit de la RT-PCR[2].
Les morpholinos ont été utilisés pour bloquer l’activité desmicro ARN[21],[22] et pour bloquer l’activité desribozymes[23]. Les fonctions des snRNP U2 et U12 ont été inhibées par les morpholinos[24]. Les morpholinos ciblant lesséquences glissantes des ARNm dans les régions codantes peuvent induire un décalage descadres de lecture[25]. Les activités des morpholinos contre cette variété de cibles suggèrent que les morpholinos peuvent être utilisés comme outils d’usage universel pour bloquer les interactions des protéines ou des acides nucléiques avec les ARNm.
Gene Tools, LLC et AVI BioPharma Inc. sont des entreprises qui revendiquent la propriété intellectuelle sur différents aspects des oligonucléotides morpholinos.
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