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Lamicrobiologie est un domaine dessciences appliquées qui a pour objet lesmicro-organismes et les activités qui les caractérisent. Plus spécifiquement, la microbiologie se consacre à l'identification et à la caractérisation des micro-organismes ; à l'étude de leur origine et de leur évolution ; à définir leurs caractéristiques, les produits de leurs activités et leurs besoins ; et à comprendre les relations qu’ils entretiennent entre eux et avec leur milieu naturel ou artificiel.
Les micro-organismes appartenant à trois règnes présentant une structure cellulaireeucaryote ouprocaryote, ou qui est eucaryote, et qui est caractérisé par l'unicellularité, une taille microscopique ou ultramicroscopique, un potentiel métabolique et de reproduction, l'omniprésence et l'abondance[1]. Les micro-organismes sont répartis en cinq groupes[1] : lesalgues, lesprotozoaires, lesmycètes, lesbactéries, lesvirus et lesprions. Les bactéries sont classées parmi lesmonères. Les algues unicellulaires font partie des protistesprocaryotes eteucaryotes. Les champignons unicellulaires, leslichens et les protozoaires sont desprotistes eucaryotes. Les virus et les prions sont desacaryotes (soit sans organisation cellulaire).
Sculpture àLille, en hommage àLouis Pasteur, au lieu précis où il a effectué ses recherches qui mèneront à la compréhension de la microbiologie actuelle.
Dès l'Antiquité, on postulait l'existence d'agents infectieux transmissibles invisibles à l'œil nu.
1546 :Jérôme Fracastor impute la transmission des maladies à des germes vivants, qu'il appelait « seminaria ».
1665 :Robert Hooke montre les structures de reproduction des moisissures et est donc le premier à décrire des micro-organismes.
1840 : Le pathologiste allemandJacob Henle propose une « théorie des germes » pour les maladies.
1857-1876 :Louis Pasteur (doyen de lafaculté des sciences de Lille) met en évidence les rôles des micro-organismes dans la fermentation lactique et alcoolique. Il développe les techniques depasteurisation et destérilisation lui permettant la mise en place de cultures pures de micro-organismes. La possibilité de culture a permis de démontrer que lagénération spontanée était une aberration.
1877-1895 :Louis Pasteur démontre que des maladies sont la conséquence de la présence de ces micro-organismes. Premières recherches systématiques sur l'origine de certaines maladies, ainsi que la vaccination (connue depuisEdward Jenner pour la variole - maladie virale).
1873-1882 :Robert Koch met en évidence le bacille responsable de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis). Koch a établi les règles (toujours utilisées) qui permettent de démontrer rigoureusement qu'une bactérie donnée est à l'origine d'une infection.
1884 :Hans Christian Gram développe une technique de coloration qui est la plus utilisée dans l'étude et la classification des bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et celles à Gram négatif.
1912 :Paul Ehrlich découvre le premier traitement efficace (dérivé d'arsenic) contre la syphilis. C'est la première fois qu'on traite avec un agent chimiothérapeutique une maladie bactérienne.
1928 : Frederick Griffith découvre la transformation bactérienne et établit les fondements de la génétique moléculaire.
1929 :Alexander Fleming découvre les propriétés antibactériennes de lapénicilline produite parPenicillum. L'humanité entre dans l'ère des antibiotiques.
1944 : Albert Schatz etSelman Waksman découvrent un autre antibiotique: lastreptomycine qui sera bientôt utilisée contre la tuberculose.
1977 :Carl Woese étudie l'ARN ribosomique pour découvrir une troisième forme de vie, lesArchaea, distincte génétiquement des bactéries et des eucaryotes.
1995 : Séquençage complet du premier génome bactérien (Haemophilus influenzae) parCraig Venter et ses collègues duTIGR. La microbiologie entre dans l'ère de la génomique.
Les procaryotesProkaryota ou Prokarya), du grec pro (avant) et caryon (noyau), sont des organismes dont la cellule ne possède pas de noyau cellulaire ni d'autres organites, ils appartiennent à au moins deux taxons distincts :
les archéobactéries ouarchées sont un groupe particulier, car il ne comprend essentiellement que des espèces anaérobies (n'ayant pas besoin d'oxygène, voire souvent ne tolérant pas l'oxygène), vivant dans des environnements extrêmes : on parle d'organisme extrémophile. Les environnements extrêmes sont à la limite des conditions tolérées par les cellules biologiques (milieu salin très acide ou très alcalin, milieu à température proche de l'ébullition). Les archéobactéries ne sont pas que des extrémophiles, ce sont aussi des organismes plus communs qui vivent dans des conditions de vie classique comme les marais ou les rumens des ruminants. Il ne faut pas associer systématiquement archéobactéries à des organismes extrêmes même si on retrouve parmi eux la plupart des extrémophiles ;
Les eucaryotes ont un système membranaire interne enfermant des organites (noyau,plaste,mitochondrie, etc.) ; ils présentent uncytosquelette interne (actine, tubuline) absent chez les procaryotes, qui leur confère une taille souvent plus importante que les procaryotes.
On estime que chaque groupe d'eucaryotes a eu un ancêtre parmi les procaryotes (archéobactéries ou eubactéries), et que les mitochondries (et peut-être aussi d'autres organites comme leschloroplastes) présents dans le cytoplasme des eucaryotes actuels ont aussi eu au moins un ancêtre procaryote distinct qui aurait colonisé cette ancienne bactérie pour vivre en symbiose (endosymbiose) avec elle et former tous les eucaryotes qui ne peuvent plus vivre sans elles.
En effet, on retrouve dans les mitochondries un cytosquelette interne spécifique, une structure membranaire externe complexe, un matériel génétique interne spécifique logé dans une zone plasmique appelée proto-noyau (dépourvu de membrane mais tout de même structurée), même si les mitochondries ne peuvent se multiplier seules sans le concours de la cellule hôte (les mitochondries auraient perdu leurs facultés de reproduction qui ne leur étaient plus nécessaires, puisque la cellule hôte leur fournit pratiquement tout le matériel nécessaire à leur croissance et leur division).
Leschampignons sont présents dans le sol, plantes, débris végétaux,lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes.
Remarque : unelevure, eucaryote unicellulaire, est un champignon. Il existe de nombreuses espèces de levures commeSaccharomyces cerevisiae (levure de boulangerie), la famille desCandida (responsables des candidoses),Rhodotorula (parfois retrouvée dans la choucroute qu'elle colore en rouge),Schizosaccharomyces, etc.
Les champignons sont « absorbotrophes » : ils se nourrissent par absorption. Ils sécrètent desenzymes qui digèrent despolymères dans le milieu extérieur, ce mécanisme chimique transforme par exemple les glucides enmonomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés.
Les champignons constituent un groupe biphylétique, car une partie d'entre eux, les eumycètes, appartiennent aux opistocontes, et une autre, les oomycètes, aux hétérocontes.
Le rapport surface sur volume est directement influencé par la taille : si l'on considère une forme simple telle que lasphère, la surface est proportionnelle au carré de la taille ( avec le rayon de la sphère), alors que le volume est proportionnel au cube de la taille (), le rapport surface/volume est donc inversement proportionnel à ().
Ceci conditionne la vitesse à laquelle le micro-organisme se nourrit : la nourriture passe à travers la membrane plasmique, donc la vitesse d'absorption est proportionnelle à la surface, mais la quantité à nourrir est proportionnelle au volume. La vitesse à laquelle entrent et sortent les nutriments et les déchets est donc inversement proportionnelle à la taille.
Donc plus la bactérie est petite, plus elle va pouvoir se nourrir à grande vitesse. Elle compense sa petite taille par une multiplication à très grande vitesse (taux de croissance très rapide).
pour les autotrophes, il suffit de CO2 atmosphérique (carbone minéral),
pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques (CH4, oses, etc.) ;
de macroéléments (ainsi appelés en raison de leur concentration dans le milieu de culture) :C,H,O,N,S,Na,Mg,P,K. Les éléments carbone, azote, phosphore doivent être présents auxproportions 100/10/1 pour un milieu correct ;
dedioxygène (oxygène moléculaire) pour lesaérobies strictes, ou d'absence de dioxygène pour les anaérobies stricts ; pour ces derniers micro-organismes, leperoxyde d'hydrogène (H2O2) formé par la réaction entre l'O2 et l'H2O les empoisonnent, car ils ne possèdent pas unecatalase dégradant H2O2, à l'inverse des individus aérobies. Il existe également des micro-organismes aérobies facultatifs capables de se multiplier en présence ou en l'absence d'oxygène grâce à leur capacité à utiliser la fermentation et des bactériesmicroaérophiles qui ne se développent qu'à une certaine pression en dioxygène ;
pour lefacteurpH, on considère que les bactéries préfèrent la neutralité excepté pour les bactéries lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus acide (pH=5).
On distingue trois types de milieux de culture selon leur composition :
Milieux synthétiques : milieux dont on peut donner la composition chimique complète. Les milieux synthétiques sont utilisés en recherche fondamentale ;
Milieux semi-synthétiques: Ils contiennent outre des substances chimiques de nature et proportions déterminées, des produits d’origine naturelle aussi définis que possibles.
Milieux empiriques : milieux dont on ne connaît que partiellement la composition.
et parmi ces deux types de milieux, il existe des milieux sélectifs (qui vont permettre de sélectionner le type de micro-organismes qui pourront s'y multiplier). On peut ainsi choisir de ne laisser se développer qu'un genre de bactérie donné (ex. : milieu mFC pour les coliformes fécaux ou gélose au sang pour certains pathogènes) ou au contraire de favoriser le développement des levures-moisissures en ajoutant un antibiotique au milieu. La température à laquelle on incubera les milieux inoculés constitue également un facteur de sélection comme mentionné plus haut.
Les milieux de culture peuvent contenir des extraits delevure (cellules de levure déshydratées et lysées) qui fournissent une source d'acides aminés, de vitamines et d'azote, des extraits de malt apportant une source de carbone, des peptones (protéines animales, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes.
Ces milieux sont soit liquides, soit solides. Pour solidifier le milieu on utilise fréquemment la gélose ouagar-agar, un polymère de sucre tiré d'une algue rouge présentant la propriété de former avec l'eau un gel solide si la température est inférieure à60 °C.
Unchallenge test est une technique permettant de démontrer l'efficacité anti-microbienne (bactériostatique oubactéricide) d'une substance donnée (produits pharmaceutiques, cosmétiques ou agroalimentaires par exemple)[3].
Lastérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet et ce, de manière durable. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes (voir aussi l'article sur l'hygiène)[4].
Il existe trois façons pour stériliser un milieu de culture. Une destruction par la chaleur, par une méthode de filtration ou par l'emploi de radiation et d'agent chimique (gaz).
On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».
Zone de stérilité d'un bec Bunsen.
chaleur sèche :
bec Bunsen : tout l'air qui se trouve dans un globe virtuel de quinze centimètres de rayon de la flamme d'un bec Bunsen, est passé une fois dans la flamme. Ceci crée une enceinte fictive stérile. Les microbiologistes travaillent avec une flamme oxydante qui crépite,
autoclave : son principe est de faire bouillir de l'eau dans une enceinte hermétiquement close pour augmenter la pression et donc dépasser les100 °C d'ébullition (principe de l'autocuiseur). Il existe différents réglages selon les éléments à stériliser, typiquement un cycle durera entre 3 et 30 min à une température de 121-134°C.[6]
Cas particuliers : la pasteurisation et tyndallisation
Dans certains cas le filtre ayant servi à stopper les micro-organismes peut être déposé sur un milieu de culture solide afin de permettre la multiplication des germes, ceci dans le but de procéder à leur dénombrement et à leur identification.
Ces techniques sont utilisées par les industries dont l'alimentaire.Elles sont très pénétrantes, car les radiations et certains gaz traversent le plastique et tuent les micro-organismes.
Les rayons ultraviolets ne sont cependant pas une bonne technique de stérilisation, car ils sont non pénétrants, donc ils ne passent pas au travers de matériaux comme le plastique et le verre. De plus certains micro-organismes sont capables de réparer les dommages infligés par les ultraviolets si le produit est éclairé après application de rayons ultraviolets ; c'est le phénomène dit « de photo-réparation ».
On peut dans certains cas utiliser lerayonnement gamma, beaucoup plus pénétrant et puissant que les ultraviolets.
Elle est basée sur la notion d'UFC (unité formant une colonie). Chaque unité cellulaire (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d'hyphe) va donner une colonie.
Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries ou de levures avec une forme particulière (la colonie). La forme de ce monticule est déterminée par l'organisation de la colonie, qui elle-même est déterminée génétiquement. Les champignons vont, eux, développer un thalle c'est-à-dire ce que l'on peut par exemple observer sur les confitures ayant « moisi.
L'UFC est utilisée aussi pour le dénombrement bactérien en utilisant des cultures surboîte de Petri à partir de tubes préparés par dilutions en cascades de la suspension bactérienne mère.
L'observation macroscopique de l'aspect des colonies permet de différencier les colonies de bactéries contaminantes de celles qu'on cherche à isoler.
Il s'agit simplement d'une suite dedilutions suivie d'un prélèvement d'un aliquot qui sera ensemencé soit par étalement ou soit en profondeur (dans la masse) sur un milieu de culture sélectif ou non contenu dans des boîtes de Petri. Après incubation des boîtes de Petri, il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume de l'aliquot (0,1 mL(ensemencement par étalement) ou 1 mL(ensemencement dans la masse ou en profondeur)), on en déduira la quantité approximative de bactéries dans le milieu.
L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des caractères les plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une espèce bactérienne donnée.
L’étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par unlaboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic.
L'état frais se fera avec une suspension de colonie qui ne sera pas fixée sur la lame comme la coloration de gram mais se fera avec une goutte de suspension entre lame et lamelle. Cette observation microscopique se fera à l'objectif x40 avec peu de lumière pour ne pas tuer les bactéries car le but de cette observation est de voir leurs mobilités (on peut voir aussi la morphologie mais cela se voit mieux en coloration de gram).
Les bactéries étant en général quasiment transparentes, on commence par préparer un étalement (faire un frottis) sur lame de microscope auquel on applique unecoloration de Gram. L'observation microscopique se fera à l'objectif x100 avec de l'huile à immersion. Les bactéries àGram positif apparaîtront mauves alors que celles àGram négatif apparaîtront roses. Il existe d'autres colorations, comme celle auvert de malachite permettant de mettre en évidence les formes sporulées.La coloration de Gram permet de déterminer le type de paroi cellulaire.
La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries dépourvues de paroi (Mycoplasmes), qui peuvent être très polymorphes, la diversité est relativement restreinte pour les bactéries d’intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, on distingue principalement des formes sphériques (cocci), cylindriques (bacille), spiralées (spirille), enroulées (spirochète) à appendice bourgeonnant ou filamenteux.
Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. Pour mettre en évidence les spores au microscope optique, il suffit de les colorer auvert de malachite ou à l'encre de Chine. Mais on peut les deviner à la coloration de Gram (absence de coloration). Les spores sont présents chez les Bacillus.
Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieursflagelle(s) leur permettant de se déplacer. Les deux mobilités les plus courantes sont la mobilité par ciliature péritriche si la bactérie se déplace dans tous les sens, soit par ciliature polaire si la bactérie part dans un seul sens.Pour définir le mode de déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La bactérie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration pour se rapprocher de sa « nourriture »
Certaine motilité dépende d'un mécanisme impliquant le pilus de type IV et de plusieurs polysaccharides comme chez la bactérieMyxococcus xanthus[7].
Lacapsule est formée depolymères (polysaccharides ou protides) disposés en couches à la périphérie de la bactérie. Celle-ci permet à la bactérie d'adhérer aux surfaces (coloniser les surfaces) et d'échapper ausystème immunitaire car lesantigènes de surface sont recouverts par la capsule qui les rend indétectables (pouvoir pathogène).
On identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met donc en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus complexes — letest de l'oxydase par exemple utilise letétraméthyl-paraphénylènediamine. On peut révéler l'utilisation de ce substrat par virage d'unindicateur de pH car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique, etc.
Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut donc les rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc.Ensuite, on dispose degaleries d'identifications biochimiques qui sont parfois vendues par des sociétés spécialisées.Ces tests sont assez longs, de un à deux jours.
On peut citer des techniques de génie génétique comme :
laPCR (Polymerase Chain Reaction) pour cibler un gène présent uniquement chez une famille ou un genre bactérien par réhybridation spécifique de courtes séquences d'ADN (oligonucléotides amorces) synthétiques précises ;
lespuces à ADN qui utilisent le même principe mais ayant une précision allant jusqu'à la souche même.
La systématique permet d'identifier une souche bactérienne inconnue grâce à différents examens et à l'utilisation de milieux de culture spécifiques.
Lacoloration de Gram et les tests de lacatalase et de l'oxydase permettent de déterminer la famille. Des milieux de cultures spécifiques permettent d'arriver au genre et à l'espèce. Des examens supplémentaires tels que le sérogroupage peuvent être utilisés dans certains cas.
Gram négatif regroupe les bactéries à paroi fine qui ne retiennent pas le bleu de gentiane/cristal. Elles apparaissent au microscope optique en rose après que l'on ajoute de la fuchsine (genre neisseria, par exemple).
la chaleur : à partir de65 °C, lesprotéines sont dénaturées, cependant certains micro-organismes sont capables de supporter des températures plus élevées ;
les hautes pressions : à partir de6 000 bar. Ainsi, c'est avec un traitement par la pression que l'on stérilise lesjus de fruits produits en industrie ;
les rayons gamma : comme les UV, ils sont très efficaces. Ils peuvent traverser tous les plastiques et servent donc à stériliser les instruments comme les fils chirurgicaux. Leur utilisation a été tentée pour les produits alimentaires, sans succès auprès du public.
Les agents chimiques utilisés se répartissent dans deux catégories :antiseptiques etdésinfectants. Les antiseptiques sont utilisés pour l'élimination des micro-organismes sur des tissus vivants ; les désinfectants quant à eux sont utilisés sur des surfaces inertes.
Les antibiotiques sont des substances chimiques qui ont une action spécifique avec le pouvoir de limiter la prolifération de bactéries spécifiques. Elles sont dépourvues de toxicité pour les autres cellules (champignons et autres eucaryotes). Ces molécules peuvent avoir une action drastique, c'est-à-dire bactéricide ; leur efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des bactéries (on parle alors d'action bactériostatique).
C'est le pouvoir ou la capacité des bactéries à augmenter leur nombre ; il est en fonction du type de bactéries (thermophiles, mésophiles, psychrophiles, psychrotrophes, etc.) Quand des bactéries sont incubées dans un milieu liquide adéquat, elles continuent généralement à se multiplier de façon exponentielle jusqu'à ce qu'un facteur nécessaire à leur croissance approche de l'épuisement et devienne limitant ou que des produits métabolites inhibiteurs (acides organiques, alcools, ammoniaque, etc.) s'accumulent exagérément. Cette culture, pratiquée sans addition de nutriment ni élimination de déchets en cours de croissance, s'appelle une culture en milieu discontinu ou en batch qui constitue un système clos. Une culture de ce type se comporte comme un organisme multicellulaire avec une limitation de croissance génétiquement déterminée.
On peut représenter graphiquement la croissance d'une culture de ce type en portant le logarithme du nombre de cellules viables en fonction du temps. La courbe obtenue pourra être divisée en six phases :
Phase de latence. C'est une période d'adaptation de la souche à son nouveau milieu. Cette phase serait inexistante si la souche était issue du même milieu de culture ;
Phase d'accélération. Au cours de cette étape, il y a synthèse active des enzymes ;
Phase de croissance exponentielle. Au cours de cette phase, la bactérie croît à un taux constant maximal ;
Phase de ralentissement. Au cours de cette phase, le milieu commence à s'épuiser : diminution de la concentration en nutriments, les déchets cellulaires commencent à s'accumuler dans le milieu ;
Phase stationnaire. Au cours de cette phase, il y a autant de bactéries qui se divisent que de bactéries qui meurent ;
Phase de déclin. Au cours de cette phase, les bactéries meurent à cause d'un manque de nutriment et d'une accumulation trop importante de déchets que la bactérie produit.
En présence de deux sources de carbone, les bactéries exhibent une courbe de croissance biphasique. Ceci s'explique par la consommation de la source de carbone la plus facilement assimilable, puis une adaptation pendant laquelle les enzymes permettant de dégrader la deuxième source de carbone sont synthétisées, puis consommation de la deuxième source de carbone (c'est le cas par exemple du milieu Kligler-Hajna. Sur ce milieu, la bactérie utilise le glucose comme première source de carbone puis le lactose comme second source de carbone lorsqu'il n'y a plus de glucose).L'analyse de ce comportement a permis àJacques Monod de définir la notion d'opéron ; le plus connu étant l'opéron lactose.
