Elle avait14 frères et sœurs parmi lesquelsAnne etConstance de Pologne (épouses successives du roiSigismond III Vasa) et l'empereurFerdinand II. Elle et ses frères et sœurs ont une vie roturière, elle avait l'habitude de se lever de bonne heure, entendait la messe et allait prier.
Elle fut une grande protectrice des arts, exerça une influence déterminante dans la vie du palais royal ; d'une profonde religiosité, elle disait entendre des voix, des visions en se rendant dans la chapelle des chambres et était toujours entourée de religieuses et de prêtres.
La reine chercha à contrer l'emprise que leduc de Lerme, favori du roi, avait sur les affaires gouvernementales, ce qui lui fit tout d'abord perdre de l'influence à la cour, mais Marguerite réussit par la suite à faire ouvrir une enquête qui dévoila un réseau de corruption impliquant le duc et ses proches, grâce à l'aide de son confesseurLuis de Aliaga(es). Ce n'est qu'après la mort de la reine que la lumière fut faite sur la corruption des grands, plusieurs d'entre eux furent condamnés, parmi lesquelsRodrigo Calderón. Le duc de Lerme parvint à être acquitté, mais dut se retirer de la vie publique en 1618. La reine ne put assister à sa chute.
Elle meurt en 1611 à l'âge de 26 ans après avoir mis au monde son huitième enfant. Elle est enterrée dans l'Escurial dans le panthéon des rois avec son époux.
Fernando Bouza,« Lectures et espaces féminins autour de la reine Marguerite de Habsbourg-Styrie (1584-1611). À propos de la circulation et de l’imitation des modèles dévotionnels de Cour », dans Murielle Gaude-Ferragu et Cécile Vincent-Cassy,« La dame de cœur ». Patronage et mécénat religieux des femmes de pouvoir dans l'Europe des xive-xviie siècles, Rennes, Presses universitaires de Rennes,, p. 137-151.
Les générations sont numérotées dans l'ordre de la descendance depuis les premiers archiducs. Au sein de chaque génération, l'ordre est strictement chronologique et défini par la date de naissance.
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