MacKinnon opiskeli aluksiMassachusettsin yliopistossa Bostonissa. Vuoden jälkeen hän siirtyiBrandeisin yliopistoon syventämään tieteiden opiskeluaan. Siellä hän suoritti alemman korkeakoulututkinnon biokemiassa vuonna 1978 opiskellessaankalsiumin kulkeutumistasolukalvon läpi Christopher Millerin laboratoriossa. Brandeisissa MacKinnon myös tapasi tulevan vaimonsa Alice Leen.
Valmistuttuaan Brandeisin yliopistosta MacKinnon siirtyiTuftsin yliopistoon opiskelemaan lääketiedettä. Hän sai lääketieteen tohtorin arvon vuonna 1982. Lääketieteellinen ura ei kuitenkaan tyydyttänyt häntä ja hän palasi takaisin Brandeisin yliopistoon vuonna 1986. Vuonna 1989 hän siirtyi apulaisprofessoriksiHarvardin yliopistoon, jossa hän tutki kaliumionikanavien aktiivisuutta erityiselläskorpionin myrkystä tehdyllä aineella. Samalla hän tutustuiröntgenkristallografiaan.
Vuonna 1996 MacKinnon siirtyiRockefeller-yliopistoon professoriksi ja molekylaarisen neurobiologian ja biofysiikan laboratorion johtajaksi. Siellä hän aloitti tutkimaan kaliumkanavien kemiallista rakennetta. Ennen MacKinnonin tutkimuksia kanavien tavasta siirtää ioneja oli vain spekulaatioita. Vuonna 1998 hänen onnistui kollegoineen selvittää kaliumionikanavien kolmiulotteinen rakenne bakteereista röntgensädekristallografian avulla ja selittää sen avulla proteiinin selektiivisyys. Proteiini päästää lävitseen vain kaliumin mutta ei pienemmännatriumin ioneita. MacKinnon on saanut lukuisia tunnustuksia työstään.