Jensen Ackles työskenteli mallina nelivuotiaasta, mutta keskittyi näyttelemiseen vuodesta 1996 lähtien. Hän esiintyi useissaMr. Rhodesin,Sweet Valley High’n jaCybillin jaksoissa ennen kun liittyiPäivien viemää -saippuasarjaan Eric Bradyn rooliin vuonna 1997. Vuonna 1998 Ackles voitti Soap Opera Digest Award -palkinnon vuoden miestulokkaana ja ansaitsiEmmy-ehdokkuuden kolmesti: vuosina 1998, 1999 ja 2000.[1]
Ackles päätti työnsäPäivien viemää -sarjassa vuonna 2000, kun hän sai osanMarilyn Monroen elämästä kertovassa minisarjassaBlonde. Seuraavaksi Ackles esiintyi sivuosassaJames Cameronin televisiosarjassaDark Angel, jossa hän esitti sarjamurhaajaa Ben/X5-493. Ackles näytteli sarjassa aina sen lopettamiseen saakka eli vuoteen 2002.
Ackles työskenteli näyttelemisen parissa koko vuoden 2003; hän liittyi muun muassaWB:n hittisarjanDawson’s Creek näyttelijäkokoonpanoon. Ackles oli tuottajien ensimmäinen vaihtoehtoEliza Dushkun hahmon rakkauden kohteeksi sarjanPelastaja toisella kaudella,[2] mutta Ackles ei kuitenkaan hyväksynyt tarjousta. Vuonna 2004 Ackles esitti jalkapallovalmentajan avustajaa sarjassaSmallville ja vuonna 2005 pääosaa elokuvassaSielunsyöjä. Kesällä 2008 Ackles valittiin näyttelemään uudelleenfilmatisoituun kauhuelokuvaanMy Bloody Valentine.
Ackles avioitui toukokuussa 2010Danneel Harrisin kanssa[5] kolmen vuoden seurustelun jälkeen. Kihloihin he olivat menneet marraskuussa 2009.[6] He saivat tyttären 2013.[7] Kaksoset, tyttö ja poika, he saivat vuoden 2016 lopussa.
