Elcultivo celular es el proceso mediante el que células, ya seancélulas procariotas oeucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotaspluricelulares, especialmentecélulas animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a lospéptidos cultivares delcultivo de tejidos y elcultivo de órganos.
El cultivo de células animales empezó a ser unatécnica rutinaria delaboratorio durante los años 50,[1] pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.[2]
ElfisiólogoinglésSydney Ringer desarrolló en la década de 1880 unasoluciónsalina, conocida comosolución de Ringer, que contienecloruro de sodio,potasio,calcio ymagnesio, dicha solución es capaz de mantener latiendo el corazón de un animal fuera del cuerpo.[3] En 1885Wilhelm Roux extrajo una porción de lamédula deembrión depollo y la mantuvo varios días en cultivo en una solución salina tibia, estableciendo el principio de loscultivos tisulares.Ross Granville Harrison, trabajando en la Escuela de Medicina de laUniversidad Johns Hopkins y más tarde en laUniversidad de Yale, estableció lametodología del cultivo tisular en una serie de trabajos publicados entre 1908 y 1910.
Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a lainvestigación envirología. La utilización de cultivos celulares para producirvirus permitió preparar virus purificados para ser utilizados envacunas. La vacuna Salk de lapolio fue una de los primeros productos producidos en masa usando técnicas de cultivos celulares. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación deJohn Franklin Enders,Thomas Huckle Weller yFrederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con elPremio Nobel por el descubrimiento de un método de crecimiento de virus en cultivos celulares deriñón de mono
Lascélulas pueden ser aisladas de lostejidos para cultivosin vitro de muchas maneras. Las células pueden ser purificadas con facilidad de lasangre, sin embargo solo losleucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las células mononucleares se pueden liberar de los tejidos blandos mediantehidrólisis enzimática conenzimas como lacolagenasa,tripsina opronasa, que degradan lamatriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de tejido en medio de crecimiento, y las células que crecen son aptas para el cultivo. Este método es el conocido comocultivo de explantos.
Las células que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen como células primarias. A excepción de algunos derivados detumores, la mayoría de los cultivos celulares primarios tienen un periodo de vida limitado. Después de un cierto número de divisiones las células entran en el proceso de senescencia y dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad.
Las células se cultivan y mantienen a una apropiadatemperatura y mezcla degases (habitualmente, 37°C, 5%CO2 y 95%O2) en un incubador celular. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de diferentesfenotipos.
Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es elmedio de crecimiento para cultivo celular. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar enpH,concentración deglucosa,factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suerobovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminación convirus opriones de los productos farmacéuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de países con un riesgo mínimo deencefalopatía espongiforme bovina, como Australia y Nueva Zelanda, y el uso de nutrientes purificada concentrados derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de células.[4]
Las células pueden crecer ensuspensión o de maneraadherente. Algunas células viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguíneo. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de células derivadas de tejidos sólidos. A las células que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos ensuspensión. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer enplástico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de lamatriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para elcrecimiento ydiferenciación. Otro tipo de cultivo adherente es elcultivo organotípico que consiste en cultivar las células en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente similar al tejido vivo. Sin embargo presenta dificultades técnicas debido a varios factores (por ejemplo: difusión).
Al estar generalmente las células en continuadivisión durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar toda elárea ovolumen disponible. Esto puede generar varios problemas:
Estos problemas pueden afrontarse mediante métodos de cultivo celular enesterilidad. El objetivo de estos métodos es evitar la contaminación conbacterias olevaduras que competirían por los nutrientes y/o podrían infectar y así eliminar las células. Toda manipulación se lleva a cabo, típicamente, en unacampana de flujo laminar para evitar la entrada demicroorganismos contaminantes. También pueden añadirseantibióticos al medio de cultivo.
Entre las manipulaciones más comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se encuentran los cambios de medio, el pase de las células y la transfección.
El objetivo de los cambios de medio es renovar los nutrientes y evitar la acumulación de productos metabólicos potencialmente tóxicos y de células muertas. En el caso de las suspensiones celulares, las células se separan del medio mediantecentrifugación y se resuspenden en medio fresco. En los cultivos adherentes, el medio puede eliminarse directamente mediante aspiración y reemplazarse por el fresco.
El pase de las células supone transferir un pequeño número de células a un nuevo continente. Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya que así se evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular. Con cultivos en suspensión el pase se hace fácilmente, tomando una pequeña cantidad de cultivo que contenga unas pocas células y diluyéndola en un volumen mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las células han de ser inicialmente despegadas; esto se efectúa comúnmente con una mezcla detripsina yEDTA, aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto. Un pequeño número de las células despegadas pueden sembrarse en un nuevo continente.
Otro método común en la manipulación de las células es la introducción de un DNA externo portransfección. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir que las células expresen una proteína de interés. Más recientemente, la transfección deRNA interferentes se han llevado a cabo como mecanismos adecuados para suprimir la expresión de un particular gen.
El DNA también puede ser introducido en las células usando virus, en métodos llamadostransducción,infección otransformación. Los virus, como agentes parásitos, son adecuados para introducir DNA en células, ya que esto forma parte de su ciclo normal de reproducción.
Las líneas celulares originadas a partir de tejido deseres humanos presentan controversiasbioéticas, ya que pueden sobrevivir a los organismos parentales y ser utilizadas para el descubrimiento de tratamientos médicos muy lucrativos después del fallecimiento de las personas que las produjeron. Una decisión pionera en este aspecto fue el fallo de la Suprema Corte de California que en 1990 determinó que los pacientes no tienen derechos propietarios sobre las líneas celulares derivadas de órganos retirados con su consentimiento.[5] Se estima que aproximadamente el 20% de las líneas celulares humanas no corresponden al tipo de células que generalmente se asume que son.[6] Esto se debe a que algunas líneas celulares crecen más rápido que otras y pueden contaminar cultivos de otras líneas celulares y, con el tiempo, sobrecrecer y desplazar a las células originales. El contaminante más común es la línea celularHeLa. Este hecho no es significativo cuando se estudian la propiedades generales delmetabolismo celular pero es muy importante en la investigación médica enfocada en un tipo específico de células. Los resultados de tales investigaciones contendrán errores, si no están completamente equivocados en sus conclusiones, con posibles consecuencias para los desarrollos terapéuticos basados en ellos.[7][8]
Es posible fusionar células normales con una línea celular inmortalizada. Con este método se produceanticuerpos monoclonales. Brevemente, los linfocito aislados delbazo omédula ósea de un ratóninmunizado se combinan con una línea celular de mieloma inmortalizada (células del linaje B) para producir unhibridoma el cual posee la especificidad de anticuerpos de los linfocito primarios y la inmortalidad de la línea celular de mieloma. Las células de mieloma sin fusionar se seleccionan en unmedio de cultivo selectivo (HA o HAT), de esta manera los linfocitos primarios mueren rápidamente y solamente las células fusionadas sobreviven. Los hibridomas productores del anticuerpo deseado se seleccionan a partir de grupos hasta llegar a colonias individuales.
El cultivo masivo de líneas celulares animales es fundamental para la manufactura devacunas virales y diversos productos biotecnológicos. Los productos biológicos producidos mediante la tecnología delADN recombinante en cultivo celular incluyenenzimas,hormonas sintéticas,inmunobiológicos (anticuerpos monoclonales,interleucinas,linfoquinas yagentes anticancerígenos). A pesar de que muchas proteínas pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos bacterianos, las proteínas más complejas que son glicosiladas (modificadas mediante el agregado decarbohidratos) deben producirse en células animales. Un ejemplo relevante de tales proteínas complejas es la hormonaeritropoyetina. Actualmente, se están realizando investigaciones para producir tales proteínas complejas en células deinsectos o deplantas superiores, debido al alto costo que implica producir tales proteínas complejas en células de mamíferos.
Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen desventajas que hay que tener en consideración. Como ventajas podemos citar:
En cuanto a las desventajas del cultivo celular:
Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular. Son:
Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son:
Salud ocupacional: Mediante ensayos citogenéticos que permiten detectar daño genético a nivel celular, donde los cultivos de linfocitos de sangre periférica son una herramienta para aplicar ensayos como: Ensayo de Micronucleos(MN), aberraciones cromosómicas (AC), Intercambio de Cromatides Hermanas (ICH, a trabajadores expuestos a algún agente citotóxico.
El cultivo celular es un componente fundamental delcultivo de tejidos y laingeniería de tejidos, ya que establece los conocimientos básicos del crecimiento y mantenimiento de célulasex vivo.
En la actualidad lasvacunas para enfermedades como elpolio,sarampión,paperas,rubéola yvaricela se producen en cultivos de células de mamíferos. El peligro que representa una posiblepandemia deinfluenza por la cepaH5N1 se están realizando activas investigaciones con el fin de producir dicho virus en cultivos celulares, financiadas por el gobierno deEstados Unidos. En marzo del 2009 se usó esta técnica para producir la primera partida de vacunas (destinadas al testeo) para la influenzaH1N1 en El D.F.[9] Entre las ideas novedosas se encuentra el uso de vacunas basadas enADN recombinante con vectores derivados deadenovirus humanos, causantes del resfrío común,[10][11] o el uso deadjuvantes.[12]
Las células de plantas se crecen normalmente ensuspensiones celulares en medio líquido o como cultivo de callos en medio sólido. El cultivo de células de plantas no diferenciadas y callos requiere de un adecuado balance de las hormonas de crecimiento vegetalesauxina ycitoquinina.
Usualmente, las cantidades pequeñas de bacterias y levaduras se crecen en medio sólido que contiene los nutrientes necesarios embebidos en un gel, tal como elAgar-Agar. Mientras que grandes cantidades son crecidas en medio líquido con las células en suspensión.
El cultivo de losvirus requiere un sustrato de células de mamíferos, plantas, hongos o bacteria como hospedadores para el crecimiento y replicación de los virus. En las condiciones adecuadas se pueden generar virus enteros, virusrecombinantes o productos virales en células diferentes a los hospedadores naturales. Dependiendo de la especie del virus y el tipo celular que se utiliza como sustrato, la replicación viral puede resultar en la lisis de la célula hospedadora y la formación de placas de lisis virales.
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