Enzymkinetik

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DieEnzymkinetik ist ein Teilgebiet derbiophysikalischen Chemie. Sie beschreibt, wie schnellenzym katalysierte chemische Reaktionen verlaufen. Die Enzymkinetik findet breite Anwendung inBiologie undMedizin, da auch biologischeSubstrate (Reaktionspartner) – darunter solche, die imMenschen auftreten – untersucht werden.Ein Hauptziel der Enzymkinetik ist die Beschreibung derKonzentrationsabhängigkeit derReaktionsgeschwindigkeit mit geeignetenFormeln, sowie die Bestimmung der dazugehörigenParameter für ein bestimmtes Protein (Enzymaktivität und katalytische Effizienz). Da Enzyme dazu dienen, Reaktionen zu beschleunigen und zu lenken, ist die enzymkinetische Analyse zum Verständnis von Enzymfunktionen unerlässlich.

Theorie für Enzyme mit einer Substratbindungsstelle

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Der Erste, der den Zusammenhang zwischen Substrat-Konzentration $[S]$ und Umsatzgeschwindigkeit eines Enzymes $v {\displaystyle v}$ beschrieb, war der französische PhysikochemikerVictor Henri 1902. Allerdings war die Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration für enzymatische Reaktionen damals noch nicht bekannt, erst nachdem Sørensen 1909 den pH-Wert definiert und die Pufferung eingeführt hatte, konnten der DeutscheLeonor Michaelis und seine kanadische Post-DoktorandinMaud Menten 1913 die Ergebnisse Henris experimentell bestätigen.^[1] Die Henri-Michaelis-Menten-Gleichung wurde 1925 von G. E. Briggs und J. B. S. Haldane verallgemeinert (Michaelis-Menten-Theorie).

Henris Schlüsselidee war, die enzymatische Reaktion in zwei Phasen zu zerlegen, die Bindung des Substrates S an das Enzym E und die Umsetzung des resultierenden Enzym-Substrat-Komplexes ES in Enzym und Produkt P:

{\begin{aligned}E+S{\underset {k_{-1}}{\overset {k_{1}}{\begin{smallmatrix}\displaystyle \longrightarrow \\\displaystyle \longleftarrow \end{smallmatrix}}}}ES{\overset {k_{cat}}{\longrightarrow }}E+P\end{aligned}}

\quad

(1)

Hierbei sind $k_{1},k_{-1},k_{cat}$ Geschwindigkeitskonstanten, die bei der kinetischen Herleitung desMassenwirkungsgesetzes (MWG) verwendet werden.^[2]Zur Beschreibung eines Reaktionsgleichgewichts der Bindungsreaktion hat die Gleichheit der Geschwindigkeiten von Hin- und Rückreaktion die Form:

k_{1}[E][S]=k_{-1}[ES];\quad \mid :[ES]\quad \mid :k_{1}

wobei $\textstyle [X]$ die Konzentration der Substanz $X {\displaystyle X}$ bezeichnet. Durch die angegebenen mathematischen Operationen entsteht für die Bindungsreaktion die eingeführte Formulierung des MWGs:

{\frac {[E][S]}{[ES]}}={\frac {k_{-1}}{k_{1}}}=K_{\mathrm {d} }.\quad

(2)

Da die (nach Standard im Zähler notierten) Reaktionsprodukte aus einer Dissoziation des Enzym-Substrat-Komplexes hervorgehen, wird die Gleichgewichtskonstante $\textstyle K_{\mathrm {d} }$ alsDissoziationskonstante bezeichnet.

Wie aus Gleichung (2) hervorgeht, hat $\textstyle K_{\mathrm {d} }$ die Dimension einer Konzentration. Für die Substratkonzentration $\textstyle [S]=K_{\mathrm {d} }$ ist die Hälfte aller Enzymmoleküle an Substrat gebunden, die andere Hälfte ist frei; dies wird alsHalbsättigung des Enzyms bezeichnet. (Die Weiterreaktion $\textstyle ES\longrightarrow E+P$ bleibt zunächst außer Betracht.)

Rechnung hierzu

K_{\mathrm {d} }={\frac {[E][S]}{[ES]}};\quad

(2)

Einsetzen von $K_{\mathrm {d} }=[S]\neq 0$ :

[S]={\frac {[E][S]}{[ES]}};\quad \mid \cdot [ES]\quad \mid :[S]\neq 0

[ES]=[E]

, wie behauptet.

$\textstyle K_{\mathrm {d} }$ ist umgekehrt proportional zurAffinität des Enzymes für das Substrat: Je besser das Enzym das Substrat bindet, umso niedriger ist die für eine Halbsättigung des Enzyms erforderliche Substratkonzentration.

Zur Beschreibung eines Reaktionsgleichgewichts der Reaktion (1) insgesamt hat die Gleichheit der Geschwindigkeiten von Hin- und Rückreaktion die Form:

k_{1}[E][S]=k_{-1}[ES]+k_{cat}[ES]=(k_{-1}+k_{cat})[ES];\quad \mid :[ES]\quad \mid :k_{1}

hierbei ist $k_{cat}$ die Geschwindigkeitskonstante der (als nicht umkehrbar vorausgesetzten) Reaktion $\textstyle ES\longrightarrow E+P$ . Durch die angegebenen mathematischen Operationen entsteht für die Reaktion (1) die eingeführte Formulierung des MWGs:

{\frac {[E][S]}{[ES]}}={\frac {k_{-1}+k_{cat}}{k_{1}}}=K_{m}.\quad

(3)

$K_{m}$ heißtMichaelis-Menten-Konstante. Zur Beschreibung der Reaktionsgeschwindigkeit $v {\displaystyle v}$ der betrachteten Katalyse wird (für entsprechend geeignete Fälle) weiter vorausgesetzt:

Die Konzentration $[E]_{t}$ des insgesamt vorhandenen Enzyms ändert sich nicht und ist die Summe aus den Konzentrationen substratgebundenen und freien Enzyms, also $[E]_{t}=[E]+[ES]$ .
Die katalysierte Reaktion isterster Ordnung, so dass ihre Geschwindigkeit zur Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes proportional ist, also $v=k_{cat}\cdot [ES]$ .
Eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit $v_{\mathrm {max} }$ wird als Rechengröße eingeführt. Diese entspricht dem fiktiven Fall, dass sämtliches vorhandenes Enzym als Enzym-Substrat-Komplex vorliegt, also $v_{\mathrm {max} }=k_{cat}\cdot [E]_{t}$ .

Durch Einführung dieser Bedingungen lässt sich (3) in dieMichaelis-Menten-Gleichung umformen, die $v {\displaystyle v}$ in Abhängigkeit von der Substratkonzentration $[S]$ darstellt:

v={\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot [S]}{K_{m}+[S]}}\quad

Umformung

${\frac {v}{v_{\mathrm {max} }}}={\frac {k_{cat}\cdot [ES]}{k_{cat}\cdot [E]_{t}}}={\frac {[ES]}{[E]_{t}}}={\frac {[ES]}{[E]+[ES]}};$

\textstyle {\frac {[E][S]}{[ES]}}=K_{M}

in den Bruch einzuführen, wird dieser mit

\textstyle {[S] \over [ES]}

erweitert:

${\frac {v}{v_{\mathrm {max} }}}={\frac {[ES]}{[E]+[ES]}}={{[ES][S] \over [ES]} \over {[E][S] \over [ES]}+{[ES][S] \over [ES]}}\quad ={[S] \over K_{M}+[S]};\quad \mid \cdot v_{\mathrm {max} }$

$v={\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot [S]}{K_{m}+[S]}};\quad$ Michaelis-Menten-Gleichung

DerGraph dieser Gleichung ist Teil einerHyperbel, die sich für zunehmende $[S]$ derwaagerechten Asymptote $v=v_{\mathrm {max} }$ nähert.

Rechnung zur Klassifikation des Graphen als Teil einer Hyperbel; Betrachtung der Asymptoten

A. Da $v_{\mathrm {max} }$ und $K_{m}$ Konstanten sind, ist die Funktion

v=f_{1}([S])={\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot K_{m}}{[S]}};\quad [S]\in \mathbb {R}

eine Hyperbel mit der waagerechten Asymptote $v=0$ für $[S]\to \pm \infty$ und der senkrechten Asymptote $[S]=0$ für $[S]\to 0$ .

Verschiebung um $-K_{m}$ in $[S]$ -Richtung ergibt:

v=f_{2}([S])={\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot K_{m}}{[S]-(-K_{m})}}={\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot K_{m}}{K_{m}+[S]}}

(Nachfolgende) Spiegelung an der [S]-Achse ergibt:

v=f_{3}([S])=-{\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot K_{m}}{K_{m}+[S]}}

(Nachfolgende) Verschiebung um $+v_{\mathrm {max} }$ in $v {\displaystyle v}$ -Richtung ergibt:

v=f_{4}([S])\quad =v_{\mathrm {max} }-{\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot K_{m}}{K_{m}+[S]}}\quad =v_{\mathrm {max} }\cdot (1-{\frac {K_{m}}{K_{m}+[S]}})\quad =v_{\mathrm {max} }\cdot {\frac {K_{m}+[S]-K_{m}}{K_{m}+[S]}}\quad ={\frac {v_{\mathrm {max} }\cdot [S]}{K_{m}+[S]}};

da $f_{4}([S])$ durch eine Verkettung von Kongruenzabbildungen aus $f_{1}([S])$ erzeugt werden kann, ist $f_{4}([S])$ ebenfalls eine Hyperbel. Der Graph der Michaelis-Menton-Gleichung ist die Teilmenge von $f_{4}([S])$ , für die $[S]\geq 0$ ist.

B. Die beiden zuerst genannten Kongruenzabbildungen ändern nichts an der waagerechten Asymptote der Hyperbel, die letztgenannte verschiebt sie um $+v_{\mathrm {max} }$ in $v {\displaystyle v}$ -Richtung. Also hat $f_{4}([S])$ die Asymptote $v=v_{\mathrm {max} }$ für $[S]\to \pm \infty$ ; der in $f_{4}([S])$ enthaltenen Graphen der Michaelis-Menton-Gleichung strebt für $[S]\to +\infty$ gegen diese Asymptote.

Die zuerst genannte Kongruenzabbildungen verschiebt die senkrechte Asymptote der Hyperbel um $-K_{M}$ in $v {\displaystyle v}$ -Richtung, die beiden letztgenannten ändern nichts an ihr. Also hat $f_{4}([S])$ die Asymptote $[S]=-K_{M}$ für $[S]\to -K_{M}$ .

Wie aus Gleichung (3) hervorgeht, hat auch $\textstyle K_{m}$ die Dimension einer Konzentration. Für die Substratkonzentration $\textstyle [S]=K_{m}$ ist $\textstyle v={\frac {v_{\mathrm {max} }}{2}}$ .

Rechnung hierzu

Einsetzen von $K_{m}=[S]$ in die Michaelis-Menton-Gleichung:

$\ v={v_{\mathrm {max} }\cdot [S] \over [S]+[S]}={v_{\mathrm {max} }\cdot [S] \over 2\cdot [S]}={\frac {v_{\mathrm {max} }}{2}}$ .

Zur Bestimmung von $v_{\text{max}}$ und $K_{m}$ aus Messreihen von $v {\displaystyle v}$ und $[S]$ dienen computergestützte Verfahren wie die nichtlineareRegressionsanalyse (Simplex- oderLevenberg-Marquardt-Verfahren). Graphische Extrapolationsverfahren (Linearisierungen) wie etwa diedoppelt-reziproke Auftragung nach Lineweaver und Burk sollten dafür nicht verwendet werden, da sie zu ungenau sind. Sie eignet sich jedoch sehr gut zur Präsentation der Ergebnisse enzymkinetischer Versuche.

Theorie für Enzyme mit mehreren Substratbindungsstellen

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Die Hill-Gleichung und ihre Herleitung aus dem Massenwirkungsgesetz

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Die Hill-Gleichung wurde ursprünglich vonArchibald Vivian Hill eingeführt, um dieSauerstoffbindung anHämoglobin in Abhängigkeit von verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen mathematisch zu beschreiben.^[3] Die hier beschriebene Hill-Gleichung ist eine andere als die Hill-Gleichung zur Beschreibung der Muskelkontraktion, an deren Erstellung der gleiche Autor beteiligt war.^[4]

Obwohl die Bindung von Sauerstoff an Hämoglobin kein katalytischer Vorgang ist, lässt sich mit einer Hill-Gleichung auch die Kinetik enzymatischer Katalysen beschreiben, insbesondere auch solcher, deren Kinetik sich nicht mit einer Michaelis-Menten-Gleichung beschreiben lässt. Hier folgt eine Herleitung der Hill-Gleichung aus dem Massenwirkungsgesetz, die die Analogie zur Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung hervorhebt. Entsprechend bedeutet die Variable $n {\displaystyle n}$ die Anzahl der Bindungsstellen, die ein Molekül Enzym für je ein Molekül Substrat bereithält, und ist damit eine positivenatürliche Zahl. Die experimentell gefundenen Werte von $n {\displaystyle n}$ weichen hiervon ab (s. u. "Der empirische Hill-Koeffizienten $n_{H}$ als Maß derKooperativität von Enzymen").

Die Bindung von $n {\displaystyle n}$ Molekülen Substrat an ein Enzym lässt sich modellieren mit:

{\begin{aligned}E+nS{\underset {k_{-1}'}{\overset {k_{1}'}{\begin{smallmatrix}\displaystyle \longrightarrow \\\displaystyle \longleftarrow \end{smallmatrix}}}}ES_{n}\end{aligned}}

\quad

(1')

Wie in Gleichung (1) sind $k_{1}',k_{-1}'$ Geschwindigkeitskonstanten, die bei der kinetischen Herleitung desMassenwirkungsgesetzes (MWG) verwendet werden. Zur Beschreibung eines Reaktionsgleichgewichts der Bindungsreaktion hat die Gleichheit der Geschwindigkeiten von Hin- und Rückreaktion die Form:

k_{1}'[E][S]^{n}=k_{-1}'[ES_{n}];\quad \mid :[ES_{n}]\quad \mid :k_{1}'\quad

hierbei ist $[E]$ die Konzentration freien Enzyms, $[S]$ die Substratkonzentration, $[ES_{n}]$ die Konzentration der Enzym-Substrat-Komplexe mit $n {\displaystyle n}$ Molekülen Substrat. Der Exponent $n {\displaystyle n}$ heißtHill-Koeffizient. Durch die angegebenen mathematischen Operationen entsteht für die Bindungsreaktion die eingeführte Formulierung des MWGs:

{\frac {[E][S]^{n}}{[ES_{n}]}}={k_{-1}' \over k_{1}'}=K_{\mathrm {D} }.\quad

(2')

Analog der Dissoziationskonstante $K_{d}$ in Gleichung (2) heißt $K_{D}$ scheinbare Dissoziationskonstante. Das Adjektiv "scheinbar" trägt der Tatsache Rechnung, dass die experimentell gemessenen Werte für $n {\displaystyle n}$ von den nach diesem Modell zu erwartenden abweichen.

Wie aus Gleichung (2') hervorgeht, hat die (neu einzuführende) Konstante

K_{A}=K{_{\mathrm {D} }}^{1 \over n}\Leftrightarrow K{_{A}}^{n}=K_{\mathrm {D} }\quad

(3')

die Dimension einer Konzentration. Für die Substratkonzentration $\textstyle [S]=K_{A}$ ist die Hälfte aller Enzymmoleküle an Substrat gebunden, die andere Hälfte ist frei; dies wird alsHalbsättigung des Enzyms bezeichnet.

Rechnung

Gleichsetzen der Gleichungen (2') und (3') ergibt:

{\frac {[E][S]^{n}}{[ES_{n}]}}=\quad K_{\mathrm {D} }=\quad K{_{A}}^{n}\quad

Einsetzen von $K_{A}=[S]$ :

[S]^{n}={\frac {[E][S]^{n}}{[ES_{n}]}};\quad \mid \cdot [ES_{n}]\quad \mid :[S]^{n}\neq 0

[ES_{n}]=[E]

, wie behauptet.

$\textstyle K_{A}$ wird daher alsHalbsättigungskonstante bezeichnet^[5] und auch $\textstyle K_{50}$ (für „50%“) geschrieben. $K_{A}$ ist (wie die Konstante $\textstyle K_{\mathrm {d} }$ der Michaelis-Menten-Gleichung) umgekehrt proportional zurAffinität des Enzymes für das Substrat: Je besser das Enzym das Substrat bindet, umso niedriger ist die für eine Halbsättigung des Enzyms erforderliche Substratkonzentration.

Wenn weiter vorausgesetzt wird,

dass sich die Konzentration $[E]_{t}$ des insgesamt vorhandenen Enzyms nicht ändert und die Summe aus den Konzentrationen substratgebundenen und freien Enzyms ist, also $[E]_{t}=[E]+[ES_{n}]$ ,

dann ist der Anteil $\theta$ substratgebundenen Enzyms an insgesamt vorhandenem mit Gleichung (2'):

\theta ={[ES_{n}] \over [E]_{t}}={[S]^{n} \over K_{D}+[S]^{n}};\quad

Hill-Gleichung

Rechnung

$\theta ={[ES_{n}] \over [E]_{t}}={[ES_{n}] \over [E]+[ES_{n}]};$

\textstyle {\frac {[E][S]^{n}}{[ES_{n}]}}=K_{\mathrm {D} }

in den Bruch einzuführen, wird dieser mit

\textstyle {[S]^{n} \over [ES_{n}]}

erweitert:

$\theta ={[ES_{n}] \over [E]+[ES_{n}]}={{[ES_{n}][S]^{n} \over [ES_{n}]} \over {[E][S]^{n} \over [ES_{n}]}+{[ES_{n}][S]^{n} \over [ES_{n}]}}\quad ={[S]^{n} \over K_{\mathrm {D} }+[S]^{n}};\quad$ Hill-Gleichung

Um mit der Hill-Gleichung die Reaktionsgeschwindigkeit $v {\displaystyle v}$ der Katalyse durch ein Enzym mit mehreren Bindungsstellen zu beschreiben, ist hinreichend, weiter vorauszusetzen:

Eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit $v_{\mathrm {max} }$ wird als Rechengröße eingeführt. Diese entspricht dem fiktiven Fall, dass sämtliches vorhandene Enzym als Enzym-Substrat-Komplex vorliegt, also $\theta =1$ .
$v\leq v_{\mathrm {max} }$ ist zum Anteil $\theta$ substratgebundenen Enzyms an insgesamt vorhandenem proportional.

Dann hat die Proportionalität die Form

{\frac {v}{v_{\text{max}}}}=\theta ;\quad

(4)

Rechnung

Wegen der vorausgesetzten Proportionalität von $v {\displaystyle v}$ und $v_{\text{max}}$ zu $\theta$ existiert ein Proportionalitätsfaktor $k {\displaystyle k}$ so, dass:

v=k\cdot \theta \quad

und

\quad v_{\text{max}}=k\cdot 1

Damit ist das Verhältnis von $v {\displaystyle v}$ zu $v_{\text{max}}$ :

{\frac {v}{v_{\mathrm {max} }}}={\frac {k\cdot \theta }{k\cdot 1}}=\theta \quad

(4)

Gleichsetzen mit der Hill-Gleichung ergibt eine Gleichung, die $v {\displaystyle v}$ in Abhängigkeit von der $n {\displaystyle n}$ -ten Potenz $[S]^{n}$ der Substratkonzentration darstellt:

v={\frac {v_{\text{max}}\cdot [S]^{n}}{K_{D}+[S]^{n}}};\quad

(5)

Rechnung

Gleichsetzen von Gleichung (4) mit der Hill-Gleichung ergibt:

{\frac {v}{v_{\text{max}}}}=\theta ={[S]^{n} \over K_{D}+[S]^{n}};\quad \mid \cdot v_{\text{max}}

$v={v_{\text{max}}\cdot [S]^{n} \over K_{D}+[S]^{n}}\quad$ (5)

Die Herleitung der Gleichung (5) ist der Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung größtenteils analog. Unterschiede sind:

Die Geschwindigkeitskonstante $k_{cat}$ der katalysierten Reaktion wird nicht in die Herleitung von Gleichung (5) einbezogen: $K_{D}$ hängt im Gegensatz zu $K_{M}$ formal nicht von $k_{cat}$ ab.
Die Ordnung der katalysierten Reaktion wird bei der Herleitung von (5) nicht explizit betrachtet.

Statt der beiden letztgenannten Voraussetzungen geht die in Gleichung (4) formulierte Proportionalität in die Herleitung ein; ein abstrakter Proportionalitätsfaktor $k {\displaystyle k}$ tritt an die Stelle von $k_{cat}$ .

Weitere Darstellung für θ und fürv. Die Sättigungsfunktion

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In der Hill-Gleichung ist $\theta$ von $n {\displaystyle n}$ und von $K_{D}$ abhängig, $K_{D}$ selbst aber auch von $n {\displaystyle n}$ (siehe Gleichung (2')). Das Verhalten der Gleichung in Abhängigkeit von $n {\displaystyle n}$ ist einheitlicher darstellbar (s. u. halblogarithmisch aufgetragene Graphen), wenn $K_{D}$ durch $K_{A}$ ersetzt wird:

\theta ={[S]^{n} \over K_{D}+[S]^{n}}={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n}};\quad

(6)

Umformung

Einsetzen von (3'): $K{_{A}}^{n}=K_{\mathrm {D} }$ in dieHill-Gleichung ergibt:

$\theta ={[S]^{n} \over [S]^{n}+K{_{A}}^{n}};\quad$ mit $\textstyle {1 \over [S]^{n}}$ erweitern und $\textstyle {[S]^{n} \over [S]^{n}}$ im Zähler und Nenner kürzen:

$\theta ={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n}};\quad$ (6)

Gleichsetzen der Gleichungen (4) und (6) ergibt eine Darstellung von $v {\displaystyle v}$ , die $K_{D}$ ebenfalls nicht mehr enthält:

v={v_{\mathrm {max} } \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n}};\quad

(7)

Rechnung

Gleichsetzen der Gleichungen (4) und (6) ergibt:

{v \over v_{\mathrm {max} }}=\theta ={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n}};\quad \mid \cdot v_{\mathrm {max} }

v={v_{\mathrm {max} } \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n}};\quad

(7)

Wenn an ein Molekül Enzym $n {\displaystyle n}$ Moleküle Substrat gebunden sind und die Konzentration der Enzym-Substrat-Komplexe $[ES_{n}]$ ist, so ist die Konzentration des gebundenen Substrats $n\cdot [ES_{n}]$ . AlsSättigungsfunktion $r {\displaystyle r}$ wird das Verhältnis der Konzentration gebundenen Substrats zur Konzentration des insgesamt vorhandenen Enzyms bezeichnet:^[6]

r={n\cdot [ES_{n}] \over [E]_{t}}

Der Zusammenhang zur Hill-Gleichung ist wegen $\textstyle \theta ={[ES_{n}] \over [E]_{t}}$ gegeben mit

r=n\cdot \theta .\quad

(8)

Der empirische Hill-Koeffizientenn_H als Maß der Kooperativität von Enzymen

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Gemäß Herleitung der Hill-Gleichung aus dem Massenwirkungsgesetz (s. o.) ist der Hill-Koeffizient $\textstyle n$ die Anzahl der Bindungsstellen eines Enzyms und daher eine natürliche Zahl. (Genau) für $\textstyle n=1$ sind die Konstanten $\textstyle K_{D}$ und $\textstyle K_{A}=K{_{D}}^{1 \over n}$ gleich. Auch sind genau für $n=1$ die Gleichungen (5) und (7) einer Michaelis-Menten-Gleichung äquivalent, indem die Konstante $\textstyle K_{D}=K_{A}$ als Michaelis-Menten-Konstante $\textstyle K_{M}$ aufgefasst wird.

Rechnung für Gleichung (7)

$v={v_{\mathrm {max} } \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n}};\quad$ (7)

n=1

einsetzen und mit

[S]

erweitern:

$v={v_{\mathrm {max} }\cdot [S] \over [S]+{K_{A}\cdot [S] \over [S]}};$

mit

K_{A}=K_{M}

$v={v_{\mathrm {max} }\cdot [S] \over [S]+K_{M}};\quad$ Michaelis-Menten-Gleichung

Zu Unterscheidung von $n {\displaystyle n}$ wird mit der Variable $n_{H}$ derjenige Hill-Koeffizient bezeichnet, für den die Hill-Gleichung die Kinetik eines solchen Enzyms empirisch am besten beschreibt. $n_{H}$ ist in der Regel kleiner als $n {\displaystyle n}$ und keine natürliche Zahl. Die Theorie der Hill-Gleichung ist bei Verwendung von $n_{H}$ nur dann mathematischkonsistent, wenn $n {\displaystyle n}$ inallen zur Beschreibung der Kinetik verwendeten Gleichungen durch $n_{H}$ ersetzt wird. $\quad \quad$ (9)

In Folgenden seien die Konstanten $K_{A}$ und $v_{\mathrm {max} }$ in allen zu vergleichenden Situationen der jeweils betrachteten Enzyme gleich. $\mathrm {-}$ Der Unterschied zwischen $n_{H}$ und $n {\displaystyle n}$ wird dadurch erklärt, dass Enzyme mit mehreren Substratbindungsstellen aus mehreren Untereinheiten bestehen, die jeweils eine Bindungsstelle tragen und demzufolge für sich betrachtet mit $n_{H}=1$ und also einer Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben werden können.

Ein alspositiveKooperativität bezeichnetes Zusammenwirken der Untereinheiten kann aber auch bewirken, dass ein solches Enzym bei einer vorgegebenen Substratkonzentration $[S]$ schneller reagiert, als gemäß einer Michaelis-Menten-Gleichung (mit $K_{M}=K_{A}$ ) zu erwarten wäre. Eine Hill-Gleichung beschreibt für Konzentrationen $[S]>K_{A}$ genau dann positive Kooperativität, wenn $n_{H}>1$ ist. Weiter reagiert ein Enzym bei positiver Kooperativität bei einer vorgegebenen Substratkonzentrationen $[S]>K_{A}$ umso schneller, je größer $n_{H}$ ist. Logische Obergrenze für $n_{H}$ ist (die Anzahl der Bindungsstellen) $n {\displaystyle n}$ .

Ganz entsprechend kann ein alsnegative Kooperativität bezeichnetes Zusammenwirken von Untereinheiten eines Enzyms bewirken, dass jenes bei einer vorgegebenen Substratkonzentration $[S]$ langsamer reagiert, als gemäß einer Michaelis-Menten-Gleichung (mit $K_{M}=K_{A}$ ) zu erwarten wäre. Eine Hill-Gleichung beschreibt für Konzentrationen $[S]>K_{A}$ genau dann negative Kooperativität, wenn $n_{H}<1$ ist, und bei einer vorgegebenen Substratkonzentrationen $[S]>K_{A}$ reagiert ein Enzym bei negativer Kooperativität umso langsamer, je kleiner $n_{H}$ ist.

Beweis

Die folgende Ungleichung (i) verwendet Gleichung (7) zur Berechnung der Geschwindigkeiten zweier Enzyme, deren Situationen sich ausschließlich im Hill-Koeffizienten $n_{H}$ bzw. $n{_{H}}'$ unterscheiden. Die folgendenÄquivalenzumformungen führen (i) auf die im Text genannten Bedingungen zurück.

{v_{\mathrm {max} } \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n_{H}}}>{v_{\mathrm {max} } \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n{_{H}}'}};\quad

(i)

der übersichtlicheren Schreibweise dient die Substitution $\textstyle q:={K_{A} \over [S]}$ . Nach (notwendiger) zusätzlicher Voraussetzung gilt

[S]>K_{A}\quad \mid :[S]>0\Rightarrow

1>{K_{A} \over [S]}=q>0,\quad

(ii)

denn für die Überlegung kann $K_{A},[S]>0$ vorausgesetzt werden. Einsetzen ergibt:

{v_{\mathrm {max} } \over 1+q^{n_{H}}}>{v_{\mathrm {max} } \over 1+q^{n{_{H}}'}};\quad \mid :v_{\mathrm {max} }>0

{1 \over 1+q^{n_{H}}}>{1 \over 1+q^{n{_{H}}'}};\quad \mid

positive Brüche stürzen

1+q^{n_{H}}<1+q^{n{_{H}}'};\quad \quad \mid -1\quad \mid :q^{n{_{H}}'}>0

q^{n_{H}-n{_{H}}'}<1;\quad \quad \quad \quad \mid \log

zu einer wählbarenBasis; mit der Rechenregel für denLogarithmus einer Potenz:

(n_{H}-n{_{H}}')\cdot \log {q}<0;\quad \mid :\log {q}<0

wegen

0<q<1

nach (ii)

n_{H}-n{_{H}}'>0\quad \Leftrightarrow \quad n_{H}>n{_{H}}'

Für $n{_{H}}'=1$ ist die rechte Seite von (i) dem Funktionsterm eine Michaelis-Menten-Gleichung äquivalent (s. o. "Rechnung zu Gleichung (7)"). Daher zeigt Betrachtung von $n{_{H}}'=1$ , dass $n_{H}>1$ in einer Hill-Gleichung für $[S]>K_{A}$ positive Kooperativität beschreibt, wie behauptet.
Betrachtung beliebiger Paare $n_{H}>n{_{H}}'>1$ zeigt, dass von zwei (vergleichbaren) Enzymen, die positive Kooperativität zeigen, dasjenige mit größerem Hill-Koeffizienten für $[S]>K_{A}$ schneller reagiert, wie behauptet.
Für $n_{H}=1$ ist die linke Seite von (i) dem Funktionsterm eine Michaelis-Menten-Gleichung äquivalent (s. o. "Rechnung zu Gleichung (7)"). Daher zeigt Betrachtung von $n_{H}=1$ , dass $n{_{H}}'<1$ in einer Hill-Gleichung für $[S]>K_{A}$ negative Kooperativität beschreibt, wie behauptet.
Betrachtung beliebiger Paare $1>n_{H}>n{_{H}}'$ zeigt, dass von zwei (vergleichbaren) Enzymen, die negative Kooperativität zeigen, dasjenige mit kleinerem Hill-Koeffizienten für $[S]>K_{A}$ langsamer reagiert, wie behauptet.

Ein Enzym mit mehreren Bindungsstellen, bei dem ein solches Zusammenwirken der Untereinheiten nicht zu beobachten ist, heißtnicht kooperativ.

Kooperativität ist nicht nur für Enzyme beschrieben, sondern auch für Nicht-Enzym-Proteine, an die mehrere andere Moleküle binden (s. o. Herleitung der Hill-Gleichung). Für diekoordinative Bindung von Sauerstoff anHämoglobin, das aus $n=4$ je ein Sauerstoffmolekül bindenden Untereinheiten besteht, wurde ein Hill-Koeffizient $n_{H}$ von 2,8 bestimmt.^[7]

Berechnung vonn_H

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Sind die Substratkonzentrationen $[S]=\mathrm {EC_{10}}$ bzw. $[S]=\mathrm {EC_{90}}$ bekannt, bei denen ein Enzym mit 10 % bzw. 90 % seiner Maximalgeschwindigkeit $v_{\mathrm {max} }$ reagiert, so lässt sich sein empirischer Hill-Koeffizient $n_{H}$ bestimmen:

n_{H}=\mathrm {\frac {\log(81)}{\log(EC_{90}/EC_{10})}}

Verallgemeinerung: Sind zwei beliebige verschiedene Substratkonzentrationen $EC_{P}$ bzw. $EC_{Q}$ bekannt, bei denen ein Enzym mit 0%< P% <100% bzw. 0%< Q% <100% seiner Maximalgeschwindigkeit $v_{\mathrm {max} }$ reagiert, so ist sein empirischer Hill-Koeffizient $n_{H}$ durch den folgenden Quotienten gegeben:

n_{H}={\bigg (}\log {\Big (}{100\cdot P-P\cdot Q \over 100\cdot Q-P\cdot Q}{\Big )}{\bigg )}:{\bigg (}\log {\Big (}{EC_{P} \over EC_{Q}}{\Big )}{\bigg )}

Herleitung

A. Mit Überlegung (9) ist bei Betrachtung des empirischen Hill-Koeffizienten $n {\displaystyle n}$ in Gleichung (6) durch $n_{H}$ zu ersetzen. Die folgenden Umformungen lösen die entstehende Gleichung nach $[S]^{n_{H}}$ auf:

\theta ={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n_{H}}};\quad \quad \mid

Übergang zur reziproken Zahl

\quad \mid -1

{1 \over \theta }-1={1-\theta  \over \theta }={{K_{A}}^{n_{H}} \over [S]^{n_{H}}};\quad \mid

Brüche stürzen

\quad \mid \cdot {K_{A}}^{n_{H}}

{{K_{A}}^{n_{H}}\cdot \theta  \over 1-\theta }=[S]^{n_{H}};\quad

(i)

B. Mit Gleichung (4):

{\frac {v}{v_{\mathrm {max} }}}=\theta ;

ist $\theta$ außer durch die Hill-Gleichung auch durch den Anteil der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit $v {\displaystyle v}$ an der Maximalgeschwindigkeit $v_{\mathrm {max} }$ gegeben; dieser Anteil kann als Prozentsatz oder als Dezimalzahl angegeben sein. - Einsetzen von $\theta =90\%=0{,}9$ für $[S]=\mathrm {EC_{90}}$ bzw. von $\theta =10\%=0{,}1$ für $[S]=\mathrm {EC_{10}}$ in (i) ergibt:

{{K_{A}}^{n_{H}}\cdot 0{,}9 \over 1-0{,}9}={K_{A}}^{n_{H}}\cdot 9=\mathrm {EC_{90}} ^{n_{H}}\quad

(ii)

{{K_{A}}^{n_{H}}\cdot 0{,}1 \over 1-0{,}1}={{K_{A}}^{n_{H}}\cdot {1 \over 9}}=\mathrm {EC_{10}} ^{n_{H}}\quad

(iii)

C. (ii) und (iii) ergeben dieProportionalität:

{\Big (}{\mathrm {EC_{90}}  \over \mathrm {EC_{10}} }{\Big )}^{n_{H}}={\mathrm {EC_{90}} ^{n_{H}} \over \mathrm {EC_{10}} ^{n_{H}}}={{K_{A}}^{n_{H}}\cdot 9 \over {{K_{A}}^{n_{H}}\cdot {1 \over 9}}}=81;

Mit einem Logarithmus zu einer wählbarenBasis und der Rechenregel für denLogarithmus einer Potenz:

n_{H}\cdot \log {\Big (}{\mathrm {EC_{90}}  \over \mathrm {EC_{10}} }{\Big )}=\log 81;\quad \mid :\log {\Big (}{\mathrm {EC_{90}}  \over \mathrm {EC_{10}} }{\Big )}>0,\quad

\mathrm {EC_{90}} >\mathrm {EC_{10}}

n_{H}={\log 81 \over \log {\Big (}{\mathrm {EC_{90}}  \over \mathrm {EC_{10}} }{\Big )}},\quad

wie angegeben.

D. Verallgemeinerung: Für zwei beliebigeverschiedene Anteile $0<p<1$ bzw. $0<q<1$ von $\theta$ und den zugehörigen Substratkonzentrationen $[S]=EC_{P=100p}$ bzw. $[S]=EC_{Q=100q}$ ergibt der gleiche Rechenweg:

{{K_{A}}^{n_{H}}\cdot p \over 1-p}={EC_{P}}^{n_{H}}\quad

(ii')

{{K_{A}}^{n_{H}}\cdot q \over 1-q}={EC_{Q}}^{n_{H}}\quad

(iii')

n_{H}\cdot \log {\Big (}{EC_{P} \over EC_{Q}}{\Big )}=\log {{{K_{A}}^{n_{H}}\cdot p \over 1-p} \over {{K_{A}}^{n_{H}}\cdot q \over 1-q}}=\log {\Big (}{p(1-q) \over (1-p)q}{\Big )}=\log {\Big (}{p-pq \over q-pq}{\Big )}=\log {\Big (}{100\cdot P-P\cdot Q \over 100\cdot Q-P\cdot Q}{\Big )},

wobei der Bruch im letzten Schritt mit $100^{2}$ erweitert wurde; mit Division durch den (nach Konstruktion von null verschiedenen) Faktor $\textstyle \log {\Big (}{EC_{P} \over EC_{Q}}{\Big )}$ folgt die angegebene Formel.

Nicht linearisierte Graphen

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Direkt-lineare Auftragung einer Enzymkinetik nach Michaelis-Menten

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Enzymkinetische Parameter lassen sich bequem und präzise direkt aus einer Sättigungshyperbel gemäß der Abbildung herleiten („direkt-lineare Auftragung“ auch „Cornish-Bowden-Diagramm“ genannt). In dieser Hyperbel ist die enzymatische Umsatzgeschwindigkeit $v {\displaystyle v}$ (Ordinate) als Funktion der Substratkonzentration $[S]$ (Abszisse) dargestellt.

Für die direkt-lineare Auftragung überträgt man die Anfangsgeschwindigkeiten des enzymatischen Umsatzes direkt in das $v {\displaystyle v}$ - $[S]$ -Diagramm. Die $[S]$ -Werte sind vor Versuchsbeginn bekannt (eingestellte Substratkonzentrationen); während der Versuchsreihe ist dann der Ordinatenwert für $v {\displaystyle v}$ (die Anfangsgeschwindigkeit) nachzutragen. Aus der maximalen Umsatzgeschwindigkeit $v_{\text{max}}$ lässt sich die halbe maximale Umsatzgeschwindigkeit ${\tfrac {1}{2}}v_{\text{max}}$ ableiten. Graphisch kann man daraus den Koordinatenwert für $K_{m}$ ermitteln. Diekatalytische Effizienz folgt übrigens aus der Steigung der Tangente an den Ursprung: ${\tfrac {v_{\text{max}}}{K_{m}}}$ ; daraus ergibt sich ${\tfrac {k_{cat}}{K_{m}}}$ .

Berechnung der Steigung der Tangente an den Ursprung

Die Funktionsgleichung der Hyperbel ist die Michaelis-Menten-Gleichung

$v([S])=\quad {\frac {v_{\mathrm {max} }[S]}{K_{\mathrm {m} }+[S]}};$

die Steigung $m_{t}$ der Tangente an den Ursprung kann alsGrenzwert einer Sekantensteigung aufgefasst werden, die durch einenDifferenzenquotienten gegeben ist. Das ergibt beiNäherung von rechts:

m_{t}=\lim _{h\rightarrow 0,\,h>0}{\frac {v(0+h)-v(0)}{h}}=\quad

\lim _{h\rightarrow 0,\,h>0}{v(h)-0 \over h}=\quad

\lim _{h\rightarrow 0,\,h>0}{\frac {v_{\mathrm {max} }h}{(K_{\mathrm {m} }+h)\cdot h}}=\quad

{\frac {v_{\mathrm {max} }}{K_{\mathrm {m} }}}.

Bemerkung: Der Standard-Weg über die Ableitung der Funktion $v([S])$ nachQuotientenregel erfordert wegen der nur einseitige Differenzierbarkeit von $v([S])$ an der Stelle $[S]=0$ zusätzliche Überlegungen und ist zudem rechenaufwändiger.

Die Fehlerbehandlung wird im direkt-linearen Plot weitgehend vereinfacht: Mittelwertsbildung gibt dann die wahrscheinlichen Werte für die Parameter $K_{m}$ und $v_{\text{max}}$ . Bei Inspektion der Streubreite der Messpunkte (nicht identisch mit derenStandardabweichung) können Ausreißer leicht identifiziert und sogenannteMediane abgelesen werden.

An dieser Stelle sei erwähnt, dass alle (auch die nachfolgenden) Auswertungsverfahren nicht nur für Enzyme, sondern auch für die Bindungsvorgänge von Carriern oder Rezeptoren Gültigkeit haben. Historisch gesehen wurden all diese Methoden (Hanes und Eadie-Hofstee-Auftragung für Enzyme, Scatchard und Hill-Auftragungen für Carrier) ursprünglich von Woolf entwickelt.

Direkt-linear aufgetragene Graphen einer Enzymkinetik nach Hill für unterschiedliche Werte vonn_H

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Die aus der Hill-Gleichung hergeleitete Gleichung (5) lässt sich als eine Funktion auffassen, die die empirisch gefundene Reaktionsgeschwindigkeit $v {\displaystyle v}$ abhängig von der Substratkonzentration $[S]$ beschreibt. Nach Überlegung (9) ist bei der Formulierung der Funktion $n {\displaystyle n}$ durch $n_{H}$ zu ersetzen:

f([S])=v={v_{\mathrm {max} }\cdot [S]^{n_{H}} \over K_{D}+[S]^{n_{H}}}.

f([S]) ist überallstreng monoton steigend und nähert sich für zunehmende $[S]$ derwaagerechten Asymptote $v=v_{\mathrm {max} }$ . Der Graph von f([S]) zeigt aber je nach Wert von $n_{H}$ unterschiedliches Verhalten:^[8]

Für $n_{H}=1$ ist er Teil einer Hyperbel, da Gleichung (5) genau dann einer Michaelis-Menten-Gleichung äquivalent ist (s. o.).
Für $n_{H}>1$ hat er genau einen Wendepunkt bei $\textstyle [S]_{w}={\Big (}K_{D}\cdot {n_{H}-1 \over n_{H}+1}{\Big )}^{1 \over n_{H}}=K_{A}\cdot {\Big (}{n_{H}-1 \over n_{H}+1}{\Big )}^{1 \over n_{H}}$ . Unter Mitberücksichtigung ihres Steigungsverhaltens ist $f([S])$ daher in diesem Fall eineSigmoidfunktion. Der Fall $n_{H}>1$ lässt sich von den Fällen $n_{H}=1$ und $n_{H}<1$ durch bloße Betrachtung des Funktionsgraphen unterscheiden.
Für $n_{H}<1$ hat er keinen Wendepunkt und sieht einem Teil einer Hyperbel ähnlich. Ein solcher Graph heißtpseudohyperbol, weil sich der Fall $n_{H}<1$ vom Fall $n_{H}=1$ durch bloße Betrachtung des Graphen nicht unterscheiden lässt.

Rechnerische Nachweise

Vorüberlegungen:

Für die vorgelegte Problemstellung kann $[S]\geq 0$ (als Definitionsbereich von $f([S])$ ) sowie $v_{\mathrm {max} },K_{D},n_{H}>0$ vorausgesetzt werden.(i)
Für beliebige $0\neq a\in \mathbb {R}$ sindPotenzfunktionen $[S]\rightarrow [S]^{a}$ streng monoton, und ihre Werte durchlaufen für $[S]>0$ sämtliche positiven reellen Zahlen.(ii)
Für beliebige $n_{H}\in \mathbb {R}$ sind für $K_{D},[S]>0$ die Potenzen $[S]^{n_{H}},[S]^{n_{H}-1},[S]^{n_{H}-2},(K_{D}+[S]^{n_{H}})^{2},(K_{D}+[S]^{n_{H}})^{3}>0$ .(iii)

A. Für beliebige $n_{H}>0\Leftrightarrow -n_{H}<0$ ergibt dieKonvergenz der Potenzfunktion:

\lim _{[S]\to \infty }{K_{D} \over [S]^{n_{H}}}=K_{D}\cdot \lim _{[S]\to \infty }[S]^{-n_{H}}=K_{D}\cdot 0=0;\quad

hieraus folgt für den Funktionsterms von

\textstyle f([S])

nach Erweitern um

\textstyle {1 \over [S]^{n_{H}}}

\lim _{[S]\to \infty }{v_{\mathrm {max} }\cdot [S]^{n_{H}} \over K_{D}+[S]^{n_{H}}}=\lim _{[S]\to \infty }{v_{\mathrm {max} }\cdot {[S]^{n_{H}} \over [S]^{n_{H}}} \over {K_{D} \over [S]^{n_{H}}}+{[S]^{n_{H}} \over [S]^{n_{H}}}}={v_{\mathrm {max} }\cdot 1 \over 0+1}=v_{\mathrm {max} },\quad

wie behauptet.

B. Die Ableitung

f'([S])={v_{\mathrm {max} }\cdot K_{D}\cdot n_{H}\cdot [S]^{n_{H}-1} \over (K_{D}+[S]^{n_{H}})^{2}}

ist mit (i) und (iii) überall positiv für $[S]>0$ , sodass $f([S])$ für alle $[S]>0$ streng monoton steigt. Zusätzliche Berücksichtigung von $f(0)=0$ und $f([S]>0)>0$ zeigt, dass $f([S])$ im gesamten Definitionsbereich streng monoton steigt, wie behauptet.

C. Die Wendepunkte von $f([S])$ sind genau dieNullstellen mit Vorzeichenwechsel der zweiten Ableitung

f''([S])=v_{\mathrm {max} }\cdot K_{D}\cdot n_{H}\cdot [S]^{n_{H}-2}\cdot {K_{D}(n_{H}-1)-[S]^{n{_{H}}}(n_{H}+1) \over (K_{D}+[S]^{n_{H}})^{3}}=a([S])\cdot {b([S]) \over c([S])},\quad

wobei für die Hilfsfunktionen

a([S]),b([S]),c([S])

gilt:

a([S])=v_{\mathrm {max} }\cdot K_{D}\cdot n_{H}\cdot [S]^{n_{H}-2}>0\quad

für

\quad [S]>0\quad

nach (i) und (iii);

b([S])=K_{D}(n_{H}-1)-[S]^{n{_{H}}}(n_{H}+1)

;

c([S])=(K_{D}+[S]^{n_{H}})^{3}>0\quad

für

\quad [S]>0\quad

nach (iii).

Da $f''([S])$ für $[S]<0$ nicht definiert ist, wechselt $f''([S])$ in $[S]=0$ nicht das Vorzeichen, und $f([S])$ hat bei $[S]=0$ keinen Wendepunkt. Außer $[S]>0$ gilt für alle Wendepunkte:

f''([S])=0\quad \Leftrightarrow \quad b([S])=0\quad \Leftrightarrow \quad [S]^{n_{H}}=K_{D}\cdot {n_{H}-1 \over n_{H}+1}=:D.\quad

(iv)

Mit (ii) hat Gleichung (iv) genau dann eine Lösung, wenn $D>0$ ist, und dann genau eine (d. h. ihre Lösung $[S]=[S]_{w}$ ist eindeutig, falls sie existiert).

Mit $K_{D}>0$ ist $D<0$ für $n_{H}<1$ , sodass keine Lösung von (iv) existiert und $f([S])$ keinen Wendepunkt hat, wie behauptet.

Mit $K_{D}>0$ ist $D>0$ für $n_{H}>1$ , sodass danngenau eine Lösung

[S]_{w}=D^{1 \over n_{H}}={\Big (}K_{D}\cdot {n_{H}-1 \over n_{H}+1}{\Big )}^{1 \over n_{H}}=K_{A}\cdot {\Big (}{n_{H}-1 \over n_{H}+1}{\Big )}^{1 \over n_{H}}

von Gleichung (iv) existiert; $f([S])$ hat bei $[S]_{w}>0$ nach (ii)höchstens einen Wendepunkt. Zu zeigen bleibt, dass $f''([S])$ in $[S]=[S]_{w}$ das Vorzeichen wechselt. Da die Bestimmung der dritten Ableitung $f'''([S])$ recht aufwendig ist, wird hier das Verhalten von $f''([S])$ in einer Umgebung ihrer Nullstellen $[S]_{w}$ untersucht.

Für beliebige $0<b,c\in \mathbb {R}$ sindPotenzfunktionen $b\rightarrow b^{c}$ streng monoton steigend. Also gilt für beliebige $\epsilon$ , für die $[S]_{w}>\epsilon >0$ ist:

([S]_{w}-\epsilon )^{n{_{H}}}<{[S]_{w}}^{n{_{H}}}\quad \mid \cdot (-(n_{H}+1))<0\quad

(wegen

n_{H}>0>-1

)

-([S]_{w}-\epsilon )^{n{_{H}}}(n_{H}+1)>-{[S]_{w}}^{n{_{H}}}(n_{H}+1)\quad \mid +K_{D}(n_{H}-1)

b([S]_{w}-\epsilon )>b([S]_{w})=0\quad \mid \cdot a([S]_{w}-\epsilon )>0\quad \mid :c([S]_{w}-\epsilon )>0

f''([S]_{w}-\epsilon )>0

Für eine geeignete $\epsilon$ -Umgebung von $[S]_{w}$ ist also $f''([S])>0$ für alle $[S]\in U_{\epsilon }([S]_{w}),\quad [S]<[S]_{w}.\quad$ (v)

Mit $[S]_{w}+\epsilon >0$ zeigen ausgehend von

([S]_{w}+\epsilon )^{n{_{H}}}>[S_{w}]^{n{_{H}}}

die entsprechenden Umformungen, dass $f''([S])<0$ für alle $[S]\in U_{\epsilon }([S]_{w}),\quad S>[S]_{w}\quad$ ist.

Letzteres zeigt zusammen mit (v) den Vorzeichenwechsel von $f''([S])$ in $[S]=[S]_{w}$ .

Halblogarithmisch aufgetragene Graphen einer Hill-Gleichung für unterschiedliche Werte vonn_H

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Einzelne Graphen der Hill-Gleichung. Die Interpretation der Achsen ist im Text angegeben. $n {\displaystyle n}$ in der Zeichnung entspricht $n_{H}$ im Text. DieAbszisse gibtkeine molaren Konzentrationen an, sondern das (dimensionslose) Verhältnis $\textstyle {[S] \over K_{A}}$ .

Einzelne Graphen der Hill-Gleichung. Die Interpretation der Achsen ist im Text angegeben. $n {\displaystyle n}$ in der Zeichnung entspricht $n_{H}$ im Text. DieAbszisse gibtkeine molaren Konzentrationen an, sondern das (dimensionslose) Verhältnis $\textstyle {[S] \over K_{A}}$ .

Im nebenstehenden Diagramm^[9] ist dieOrdinate der Anteil $\theta$ substratgebundenen Enzyms an insgesamt vorhandenem. DieAbszisse gibt das Verhältnis $\textstyle {[S] \over K_{A}}$ an; sie ist logarithmisch geteilt. Bei Verwendung desdekadischen Logarithmus ist

wegen $\lg(1)=0$ der Punkt „1“ Nullpunkt der Abszisse und
wegen $\lg(1)=0$ und $\lg(10)=1$ der Abstand zwischen den Punkten „1“ und „10“ Längeneinheit der Abszisse.

Für beliebiges $x\in \mathbb {R}$ bezeichnet ein $x {\displaystyle x}$ Längeneinheiten vom Nullpunkt entfernter Punkt der Abszisse die Substratkonzentration $[S]=10^{x}\cdot K_{A}$ , wobei der Faktor $10^{x}$ auf der Abszisse ablesbar ist. Jeder Graph des Diagramms zeigt eine Hill-Gleichung der Form (6):

\theta ={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n_{H}}}

Erläuterung

Jeder Graph des Diagramms zeigt eine Funktion

\theta ={1 \over 1+(10^{-x})^{n_{H}}}

wie durch Betrachtung des Verhaltens dieser Funktion für $x=0$ (am Nullpunkt "1" der Abszisse) und für $x\rightarrow \pm \infty$ anschaulich wird. Einsetzen von

(\quad [S]=10^{x}\cdot K_{A}\Leftrightarrow \quad {[S] \over K_{A}}=10^{x}\Leftrightarrow \quad )\quad {K_{A} \over [S]}=10^{-x}

zeigt, dass jeder Graph auch eine Hill-Gleichung der Form (6) darstellt:

\theta ={1 \over 1+(10^{-x})^{n_{H}}}={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n_{H}}}

Für je einen vorgegebene Hill-Koeffizienten $n_{H}$ ist im Diagramm der Graph der Hill-Gleichungen zu allen Werten von $K_{A}$ gleich, da $\textstyle \theta$ nicht direkt von $\textstyle K_{A}$ abhängt, sondern vom Verhältnis $\textstyle {K_{A} \over [S]}(=10^{-x})$ . Die Gesamtheit der Graphen bildet für beliebige positive $\textstyle n_{H}$ eine (einparametrige)Schar direkt vergleichbarer Kurven; Teile einer Hyperbel oder pseudohyperbole Kurvenverläufe treten nicht auf.

Jeder Graph des Diagramms ist auch Graph einerlogistischen Funktion $f_{n_{H}}\colon x\rightarrow f(x)=\theta$ und hat daher

für $x\rightarrow \infty \quad (\Leftrightarrow [S]\rightarrow \infty )\quad$ die Asymptote $\theta =1$ sowie
für $x\rightarrow -\infty \quad (\Leftrightarrow [S]\rightarrow 0)\quad$ die Asymptote $\theta =0$ ;
jeder Graph istpunktsymmetrisch mit Symmetriezentrum $\textstyle W(1\mid {\frac {1}{2}})$ ;
$W {\displaystyle W}$ ist der Wendepunkt jeder Funktion $f_{n_{H}}$ ;
die Steigung von $f_{n_{H}}$ in $W {\displaystyle W}$ ist $\textstyle {n_{H}\cdot \ln(10) \over 4}\approx 0{,}5756\cdot n_{H}$ . In diesem Sinne nimmt die Steilheit des Graphen mit $n_{H}$ zu.

Beweis

Dieallgemeine logistische Funktion $f_{G,c,k}:x\rightarrow f(x)=\theta$ kann geschrieben werden:

$\theta ={G \over 1+e^{c}\cdot e^{-kGx}}$ ;

mit $\quad G=1,\quad c=0,\quad k=n_{H}\cdot \ln(10),\quad [S]=10^{x}\cdot K_{A}\Leftrightarrow \quad {K_{A} \over [S]}=10^{-x}\quad$ hat $f_{n_{H}}$ die Form:

$\theta ={1 \over 1+e^{0}\cdot e^{-\ln(10)\cdot n_{H}\cdot 1\cdot x}}=\quad {1 \over 1+1\cdot 10^{-n_{H}\cdot x}}=\quad {1 \over 1+(10^{-x})^{n_{H}}}\quad ={1 \over 1+({K_{A} \over [S]})^{n_{H}}}\quad$ (6), q. e. d.

Die Eigenschaften der allgemeinen logistischen Funktion setzen sich auf $f_{n_{H}}$ wie folgt fort:

Für $x\rightarrow \infty \quad (\Leftrightarrow 10^{x}\cdot K_{A}=[S]\rightarrow \infty )$ ist $\theta =G=1$ Asymptote, q. e. d.,
für $x\rightarrow -\infty \quad (\Leftrightarrow 10^{x}\cdot K_{A}=[S]\rightarrow 0)$ ist $\theta =0$ Asymptote, q. e. d.;
jeder Graph ist punktsymmetrisch mit Symmetriezentrum $\textstyle W(x_{w}\mid {\frac {G}{2}})=W(x_{w}\mid {\frac {1}{2}})$ ;

mit

\textstyle x_{w}={c \over k\cdot G}

und

\textstyle c=0

ist

\textstyle x_{w}=0\quad (\Leftrightarrow 10^{x_{w}}=1)

, q. e. d.;

$W {\displaystyle W}$ ist Wendepunkt von $f_{n_{H}}$ , q. e. d.;
die Steigung von $f_{n_{H}}$ in $W {\displaystyle W}$ ist $\textstyle {\frac {k\cdot G^{2}}{4}}={\frac {k}{4}}={\frac {n_{H}\cdot \ln(10)}{4}}$ , q. e. d.

Weiter gehört jede logistische Funktion zu denSigmoidfunktionen, d. h. jeder ihrer Graphen verläuft S-förmig.

Linearisierungsverfahren

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Linearisierungsverfahren wurden in der Vergangenheit sehr häufig für die schnelle grafische Bestimmung der wichtigen Kinetikparameter $K_{m}$ und $v_{\text{max}}$ verwendet. Sie sind zwar einprägsam und verbreitet, führen jedoch zu einer teils erheblichen Verfälschung des Ergebnisses durch Messfehler und sind zur Fehlerbetrachtung mehr oder weniger ungeeignet. Mittlerweile hat die Ermittlung der Michaelis-Menten-Parameter durch nichtlineare Regression stark an Bedeutung gewonnen, die zu deutlich genaueren Ergebnissen führt. Deshalb sollen die Linearisierungsverfahren hier nur gestreift werden.

Lineweaver-Burk-Diagramm

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Hans Lineweaver (1907–2009) undDean Burk (1904–1988) haben 1934 eine doppelt-reziproke Darstellung vorgestellt, bei der ${\tfrac {1}{v}}$ als Funktion von ${\tfrac {1}{[S]}}$ aufgetragen wird.^[10]

Eine Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung ergibt die folgende Gleichung:

{1 \over v}={K_{m} \over v_{\text{max}}}{1 \over [S]}+{1 \over v_{\text{max}}}

Umformung

$v=\quad {\frac {v_{\mathrm {max} }[S]}{K_{\mathrm {m} }+[S]}};\quad$ (Michaelis-Menten) $\quad \mid$ Übergang zur reziproken Zahl

${\frac {1}{v}}=\quad {\frac {K_{\mathrm {m} }+[S]}{v_{\mathrm {max} }[S]}}=\quad {\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\mathrm {max} }[S]}}+{\frac {[S]}{v_{\mathrm {max} }[S]}};$

${1 \over v}={K_{m} \over v_{\text{max}}}{1 \over [S]}+{1 \over v_{\text{max}}};\quad$ (Lineweaver-Burk)

Die Steigung dieserlinearen Funktion beträgt $\textstyle {K_{m} \over v_{\text{max}}}$ ; sie schneidet

die $\textstyle {\frac {1}{v}}$ -Achse bei $\textstyle {\frac {1}{v}}={1 \over v_{\text{max}}}$ (Ordinatenabschnitt) und
die $\textstyle {1 \over [S]}$ -Achse bei $\textstyle {1 \over [S]}=-{\tfrac {1}{K_{m}}}$ (Abszissenabschnitt).

Rechnung zu Achsenabschnitten und Steigung

Indem $\textstyle {1 \over [S]}$ alsArgument einer Funktion aufgefasst wird, beschreibt die Gleichung

{1 \over v}={K_{m} \over v_{\text{max}}}{1 \over [S]}+{1 \over v_{\text{max}}}

einelineare Funktion. Für diese lassen sichSteigung $\textstyle {K_{m} \over v_{\text{max}}}$ undOrdinatenabschnitt $\textstyle {1 \over v_{\text{max}}}$ direkt aus der Funktionsgleichung ablesen.

Sei

$Q {\displaystyle Q}$ der Koordinatenursprung,
$R {\displaystyle R}$ der Schnittpunkt desGraphen der Gleichung mit der $\textstyle {1 \over [v]}$ -Achse, sodass $Q R {\displaystyle QR}$ derOrdinatenabschnitt der Funktion ist, und
$P {\displaystyle P}$ der Schnittpunkt desGraphen der Gleichung mit der $\textstyle {\frac {1}{[S]}}$ -Achse, sodass $P Q {\displaystyle PQ}$ derAbszissenabschnitt der Funktion ist. Die $\textstyle {\frac {1}{[S]}}$ -Koordinate von $P {\displaystyle P}$ sei $-p$ .

Dann ist das Dreieck $Q R P {\displaystyle QRP}$ einemSteigungsdreieck ähnlich. Also gilt für das Verhältnis der Streckenlängen von Ordinaten- und Abszissenabschnitt:

|QR|:|PQ|=\quad {1 \over v_{\text{max}}}:p=\quad {K_{m} \over v_{\text{max}}};\quad \mid \cdot v_{\text{max}}

{1 \over p}=K_{\mathrm {m} };\quad \mid

Übergang zur reziproken Zahl

\quad \mid \cdot (-1)

-p=-{\frac {1}{K_{\mathrm {m} }}}

, wie in der Zeichnung angegeben.

Obwohl sie zur Datenrepräsentation meist verwendet wird, ist diese Methode zur Auswertung jedoch unverlässlich. Kleine Fehler in $v {\displaystyle v}$ ergeben bei kleinen $[S]$ -Werten eine große Abweichung in ${\tfrac {1}{v}}$ , bei großen $[S]$ -Werten ist diese eher zu vernachlässigen. Die Autoren der Methode haben die Unsicherheit großer ${\tfrac {1}{v}}$ Werte betont und darauf hingewiesen, dass diese grundsätzlich geringer zu gewichten sind. Spätere Anwender haben dies zumeist ignoriert. Wo immer möglich sollte dieses durch Computerverfahren zur Bestimmung enzymkinetischer Parameter ersetzt werden.

Eadie-Hofstee-Diagramm

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Das Eadie-Hofstee-Diagramm, auch Woolf–Eadie–Augustinsson–Hofstee- oder Eadie–Augustinsson-Diagramm, nimmt eine Mittelstellung ein. Hierbei wird $v {\displaystyle v}$ als Funktion von ${\tfrac {v}{[S]}}$ aufgefasst. Die zugehörige Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung ergibt:

v=-K_{m}{v \over [S]}+v_{\text{max}}

Umformung

$v=\quad {\frac {v_{\mathrm {max} }[S]}{K_{\mathrm {m} }+[S]}};\quad$ (Michaelis-Menten)

$v=\quad v_{\mathrm {max} }\cdot {\frac {[S]}{K_{\mathrm {m} }+[S]}};\quad \mid \cdot {\frac {K_{\mathrm {m} }+[S]}{[S]}}$

$v\cdot {\frac {K_{\mathrm {m} }+[S]}{[S]}}=v_{\mathrm {max} }$

Umformung der linken Seite: $\quad v\cdot {\frac {K_{\mathrm {m} }+[S]}{[S]}}=\quad v\cdot ({\frac {K_{\mathrm {m} }}{[S]}}+1)=\quad v\cdot {\frac {K_{\mathrm {m} }}{[S]}}+v;\quad$ einsetzen:

$v\cdot {\frac {K_{\mathrm {m} }}{[S]}}+v=v_{\mathrm {max} }\quad \mid -{\frac {v\cdot K_{\mathrm {m} }}{[S]}}$

$v=-K_{\mathrm {m} }\cdot {\frac {v}{[S]}}+v_{\mathrm {max} };\quad$ (Eadie-Hofstee)

Aus dem Diagramm lässt sich auf der $v {\displaystyle v}$ -Achse alsOrdinatenabschnitt $v_{\text{max}}$ ablesen, aus der (negativen)Steigung $-K_{m}$ der Regressionsgeraden $K_{m}$ bestimmen.

Der Fehler wächst mit v/[S]. Da v bei beiden Koordinaten eingeht, konvergieren alle Abweichungen zum Ursprung.

Scatchard-Diagramm

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DasScatchard-Diagramm fasst umgekehrt $v/[S]$ als Funktion von $v {\displaystyle v}$ auf. Es entsteht aus dem Eadie-Hofstee-Diagramm durch Vertauschung der Achsen (oder äquivalent: durch Spiegelung des Diagramms insgesamt an der1. Winkelhalbierenden des Koordinatensystems). Die entsprechende Umformung der zum Eadie-Hofstee-Diagramm gehörigen Gleichung ergibt:

${\frac {v}{[S]}}=-{\frac {1}{K_{m}}}\cdot v+{\frac {v_{\text{max}}}{K_{m}}}$

Umformung

$v=-K_{m}{v \over [S]}+$ $v_{\text{max}};\quad$ (Eadie-Hofstee) $\quad \mid -v_{\text{max}}$

$v-v_{\text{max}}=$ $-K_{m}{v \over [S]};\quad \mid :(-K_{m})\neq 0$

${v-v_{\text{max}} \over -K_{m}}=\quad {v_{\text{max}}-v \over K_{m}}=\quad {v \over [S]};$

${v \over [S]}=-{v \over K_{m}}+{v_{\text{max}} \over K_{m}}=\quad -{1 \over K_{m}}\cdot v+{v_{\text{max}} \over K_{m}}.\quad$ (Scatchard)

Aus dem Diagramm lässt sich ebenfalls auf der $v {\displaystyle v}$ -Achse, die nunAbszisse ist, $v_{\text{max}}$ alsAbszissenabschnitt ablesen, denn ein Ordinatenabschnitt des Eadie-Hofstee-Diagramms geht durch die genannte Spiegelung in einen Abszissenabschnitt des Scatchard-Diagramms über. Ebenso lässt sich aus der (negativen)Steigung $\textstyle -{1 \over K_{m}}$ der Regressionsgeraden durch Übergang zur reziproken Zahl und Vorzeichenwechsel $K_{m}$ bestimmen. DerOrdinatenabschnitt der Gerade im Scatchard-Diagramm ist der im Abschnitt "Direkt-lineare Auftragung" als Maß der katalytischen Effizienz genannte Bruch.

DasScatchard-Diagramm wird zumeist zur Repräsentation von Bindungsmessungen (anstelle enzymkinetischer Daten) angewendet. Scatchard- und Eadie-Hofstee-Diagramme gelten als die besten Werkzeuge zur Diagnosekooperativer Phänomene. Im Falle negativer Kooperativität oder nicht-identischer, isolierter Bindungsplätze entsteht ein konkaver Verlauf mit linearem Endast. Die Steigungen entsprechen hier den Affinitäten (K_d beziehungsweise $K_{m}$ ) und die Gesamtzahl der Bindungsplätze (aktiven Zentren) ist aus dem Schnittpunkt mit der $v {\displaystyle v}$ -Achse abzulesen.

Hanes-Woolf-Diagramm (Hanes(-Wilkinson)-Diagramm)

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DasHanes-Woolf-Diagramm^[11] ist die bestmögliche lineare Auftragungsmöglichkeit. Es geht aufCharles Samuel Hanes (1903–1990) undBarnet Woolf (1902–1983) zurück. Hierbei wird eine Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung verwendet, die [S]/v als Funktion von [S] darstellt:

{[S] \over v}={1 \over v_{\text{max}}}[S]+{K_{m} \over v_{\text{max}}}

Umformung

$v=\quad {\frac {v_{\mathrm {max} }[S]}{K_{\mathrm {m} }+[S]}};$ $\quad$ (Michaelis-Menten) $\quad \mid :[S]\neq 0$ $\quad \mid$ Brüche stürzen

${\frac {[S]}{v}}=\quad {\frac {K_{\mathrm {m} }+[S]}{v_{\mathrm {max} }}}=\quad {\frac {[S]}{v_{\mathrm {max} }}}+{\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\mathrm {max} }}};$

${\frac {[S]}{v}}=\quad {\frac {1}{v_{\text{max}}}}\cdot [S]+{\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\text{max}}}};\quad$ (Hanes-Woolf)

Die Steigung dieserlinearen Funktion beträgt $\textstyle {\frac {1}{v_{\mathrm {max} }}}$ ; sie schneidet

die $\textstyle {\frac {[S]}{v}}$ -Achse bei $\textstyle {\frac {[S]}{v}}={\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\mathrm {max} }}}$ (Ordinatenabschnitt) und
die $\textstyle [S]$ -Achse bei $\textstyle [S]=-K_{\mathrm {m} }$ (Abszissenabschnitt).

Rechnung zu Achsenabschnitten und Steigung

Für dielineare Funktion mit der Gleichung

{\frac {[S]}{v}}=\quad {\frac {1}{v_{\mathrm {max} }}}\cdot [S]+{\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\mathrm {max} }}};\quad

lassen sichSteigung $\textstyle {\frac {1}{v_{\mathrm {max} }}}$ undOrdinatenabschnitt $\textstyle {\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\mathrm {max} }}}$ direkt aus der Funktionsgleichung ablesen.

Sei

$Q {\displaystyle Q}$ der Koordinatenursprung.
$R {\displaystyle R}$ der Schnittpunkt desGraphen der Gleichung mit der $\textstyle {[S] \over v}$ -Achse, sodass $Q R {\displaystyle QR}$ derOrdinatenabschnitt der Funktion ist, und
$P {\displaystyle P}$ der Schnittpunkt desGraphen der Gleichung mit der $\textstyle [S]$ -Achse, sodass $P Q {\displaystyle PQ}$ derAbszissenabschnitt der Funktion ist. Die $\textstyle [S]$ -Koordinate von $P {\displaystyle P}$ sei $-p$ .

Dann ist das Dreieck $Q R P {\displaystyle QRP}$ einemSteigungsdreieck ähnlich. Also gilt für das Verhältnis der Streckenlängen von Ordinaten- und Abszissenabschnitt:

|QR|:|PQ|=\quad {\frac {K_{\mathrm {m} }}{v_{\mathrm {max} }}}:p=\quad {\frac {1}{v_{\mathrm {max} }}};\quad \mid \cdot v_{\mathrm {max} }

{K_{\mathrm {m} } \over p}=\quad 1;\quad \mid \cdot (-p)

-K_{\mathrm {m} }=\quad -p,\quad

wie in der Zeichnung angegeben.

Fehler in [S]/v sind eine weit bessere Annäherung der Fehler in v. Aufgrund einer unverfälschten Spreizung der Messpunkte entlang der [S]-Achse wird das Ergebnis durch einzelne Ausreißer prinzipiell weniger verfälscht. Da aber abhängige und unabhängige Variable vermischt werden, ist auch hier eine Datenoptimierung durchlineare Regression nicht sinnvoll.

Hill-Diagramm

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Das Hill-Diagramm ist eine Darstellung der Hill-Gleichung, in der $\textstyle \log {\theta \over 1-\theta }$ (Ordinatenwert) als Funktion von $\log {[S]}$ (Abszissenwert) aufgetragen wird. Die zugehörige Umformung der Hill-Gleichung ergibt:

\log \left({\dfrac {\theta }{1-\theta }}\right)=n_{H}\log {[S]}-\log {K_{D}};\quad

(10)

Umformung

DieHill-Gleichung wird nach Ersetzen vom $n {\displaystyle n}$ durch $n_{H}$ gemäß Überlegung (9) zu:

$\theta ={\frac {[S]^{n_{H}}}{K_{D}+[S]^{n_{H}}}};\quad \mid$ Übergang zur reziproken Zahl

${\frac {1}{\theta }}={\frac {K_{D}+[S]^{n_{H}}}{[S]^{n_{H}}}}={\frac {K_{D}}{[S]^{n_{H}}}}+1;\quad \mid -1$

${\frac {1}{\theta }}-1={\frac {1-\theta }{\theta }}={\frac {K_{D}}{[S]^{n_{H}}}};\quad \mid$ Brüche stürzen

${\frac {\theta }{1-\theta }}={\frac {[S]^{n_{H}}}{K_{D}}};\quad \mid \log$ zu einer wählbarenBasis;

mit der Rechenregel für denLogarithmus eines Quotienten bzw. denLogarithmus einer Potenz:

$\log \left({\frac {\theta }{1-\theta }}\right)=\quad \log \left({\frac {[S]^{n_{H}}}{K_{D}}}\right)=\quad \log \left([S]^{n_{H}}\right)-\log K_{D}=\quad n_{H}\cdot \log[S]-\log K_{D};\quad$ (10)

Bei Verwendung von $K_{A}$ hat (10) die Form:

\log \left({\dfrac {\theta }{1-\theta }}\right)=n_{H}\log {[S]}-n_{H}\log {K_{A}};\quad

(10a)

Umformung

Die Definition der Halbsättigungskontante $K_{A}$ in Gleichung (3') wird nach Ersetzen vom $n {\displaystyle n}$ durch $n_{H}$ gemäß Überlegung (9) zu:

K{_{A}}^{n_{H}}=K_{D}\quad \mid \log

zur gleichenBasis wie

\log {[S]}

mit der Rechenregel für denLogarithmus einer Potenz:

n_{H}\log {K_{A}}=\log {K_{D}};

dies kann in (10) eingesetzt werden.

Auch in den hier folgenden Gleichungen kann $n_{H}\log {K_{A}}$ an die Stelle von $\log {K_{D}}$ treten.

Ist $v_{\mathrm {max} }$ bekannt, so lassen sich die Ordinatenwerte unter Verwendung von $v {\displaystyle v}$ bestimmen:

\log \left({\dfrac {v}{v_{\mathrm {max} }-v}}\right)=n_{H}\log {[S]}-\log {K_{D}};\quad

(10b)

Umformung

Die Gleichungen (10) und (10b) sind äquivalent, wenn das Argument des Logarithmus der linken Seite für beide Gleichungen übereinstimmt. Einsetzen von Gleichung (4) und Erweitern mit $v_{\mathrm {max} }$ ergibt:

{\theta  \over 1-\theta }={{v \over v_{\mathrm {max} }} \over 1-{v \over v_{\mathrm {max} }}}={v \over v_{\mathrm {max} }-v}

Die Sättigungsfunktion $r {\displaystyle r}$ kann in die Gleichung eingeführt werden:

\log \left({\dfrac {r}{n_{H}-r}}\right)=n_{H}\log {[S]}-\log {K_{D}};\quad

(10c)

Umformung

Die Definition der Sättigungsfunktion $r {\displaystyle r}$ nach Gleichung (6) wird nach Ersetzen vom $n {\displaystyle n}$ durch $n_{H}$ gemäß Überlegung (9) zu:

r=n_{H}\cdot \theta ;\quad

(i)

die Gleichungen (10) und (10c) sind äquivalent, wenn das Argument des Logarithmus der linken Seite für beide Gleichungen übereinstimmt. Erweitern mit $n_{H}$ und Einsetzen von (i) ergibt:

{\frac {\theta }{1-\theta }}={n_{H}\cdot \theta  \over n_{H}-n_{H}\cdot \theta }={\frac {r}{n_{H}-r}}

Insoweit die Hill-Gleichung eine Enzymkinetik zutreffend beschreibt, zeigt das Hill-Diagramm eine Gerade $g {\displaystyle g}$ , aus der sich

$n_{H}$ als deren Steigung und
$\log {K_{A}}$ alsAbszissenabschnitt (= Abszissenwert des Schnitts von $g {\displaystyle g}$ mit der Abszisse)

ablesen lässt; hieraus lässt sich nach Delogarithmieren $K_{A}$ und nach Berechnung von $\log {K_{D}}=n_{H}\log {K_{A}}$ und anschließendem Delogarithmieren auch $K_{D}$ bestimmen.

Begründung und Rechenhinweise

A. Diejenigen Varianten der Gleichung (10), die den Summanden $-\log K_{D}$ enthalten, haben die Form

Ordinatenwert =

n_{H}\cdot

Abszissenwert + Ordinatenabschnitt

und sind daher als Funktionsvorschrift einerlinearen Funktion mit Steigung $n_{H}$ deutbar, deren Graph die angegebene Gerade $g {\displaystyle g}$ ist.

B. Zur Bestimmung des Abszissenabschnitts $\log {[S]}=(\log[S])_{0}$ einer solchen linearen Funktion ist ihr Ordinatenwert null zu setzen:

0=\quad n_{H}\cdot (\log[S])_{0}-\log {K_{D}}=\quad n_{H}\cdot (\log[S])_{0}-n_{H}\cdot \log {K_{A}};\quad \mid -n_{H}\cdot (\log[S])_{0}\quad \mid :(-n_{H})\neq 0

(\log[S])_{0}=\log {K_{A}},

wie im Text angegeben.

Bemerkung: Diejenigen Varianten der Gleichung (10), die den Summanden $-n_{H}\log {K_{A}}$ enthalten, sind Geradengleichungen der Form:

Ordinatenwert =

n_{H}\cdot

Abszissenwert -

n_{H}\cdot

Abszissenabschnitt =

n_{H}\cdot

(Abszissenwert - Abszissenabschnitt)

C. Ist $b {\displaystyle b}$ die Basis des gewählten Logarithmus, sodass $\log {_{b}}{K_{A}}$ als Abszissenabschnitt aus dem Hill-Diagramm ablesbar ist, so ist die Formel zum Delogarithmieren $K_{A}=b^{\log {_{b}}{K_{A}}}$ . Entsprechend zum Delogarithmieren von $\log {_{b}}{K_{D}}$ .

Aus mathematischer Sicht könnte zur hier beschriebenen Rechnung eine beliebige Basis verwendet werden, üblich sind jedoch vor allem

die Basis 10 desdekadischen Logarithmus', der meist mit $\lg$ bezeichnet wird, also $K_{A}=10^{\lg {K_{A}}}$ und
die Basise desnatürlichen Logarithmus', der meist mit $\ln$ bezeichnet wird, also $K_{A}=e^{\ln {K_{A}}}$ ;

jeweils entsprechend zum Delogarithmieren von $\lg {K_{D}}$ bzw. $\ln {K_{D}}$ .

Im angelsächsischen Sprachraum wird nicht nur der allgemeine, sondern auch der natürliche Logarithmus zuweilen mit $\log$ bezeichnet (was zu Verwechselungen führen kann).

(Idealisierte) Hill-Diagramme; der Hill-Koeffizient $n_{H}$ ist mit $n {\displaystyle n}$ bezeichnet. - Erläuterung der Achsen und ihrer Beschriftung im Text.

{\displaystyle n_{H}} — (Idealisierte) Hill-Diagramme; der Hill-Koeffizient $n_{H}$ ist mit $n {\displaystyle n}$ bezeichnet. - Erläuterung der Achsen und ihrer Beschriftung im Text.

Im nebenstehenden Hill-Diagrammen^[12] ist die Abszissenvariable $\textstyle \log {[S]}$ mit $\textstyle \log {[X]}$ bezeichnet, der Abszissenabschnitt $\textstyle \log {K_{A}}$ mit $\textstyle \log {K_{d}}$ , die Ordinatenvariable $\textstyle {\log {\theta \over 1-\theta }}$ mit $\textstyle {\log {Y \over 1-Y}}$ . (Die Längeneinheit ist für beide Achsenunterschiedlich gewählt, sodass die Steigung der roten Geradenicht $\approx 1$ ist. Der Schnitt einer Gerade mit der eingezeichneten Ordinate, dienicht durch den Nullpunkt der Abszisse führt, istnicht der Ordinatenabschnitt der jeweiligen Gerade.)

Für den gleichen Abszissenabschnitt $\textstyle \log {K_{A}}=-6$ (und damit den für beide Geraden gleichen Wert von $K_{A}$ ) ist

die rote Gerade das Hill-Diagramm eines hochkooperativen Enzyms (Schnitt mit der Ordinate bei $\textstyle \approx -12\Rightarrow$ Geradensteigung $\quad \textstyle n_{H}\approx {0-(-12) \over (-6)-(-9)}=4$ );
die grüne Gerade dasjenige eines kaum oder nicht kooperativen Enzyms (Schnitt mit der Ordinate bei $\textstyle \approx -3\Rightarrow$ Geradensteigung $\quad \textstyle n_{H}\approx {0-(-3) \over (-6)-(-9)}=1$ ).

Wenn die berechneten Wertepaare nicht auf einer Gerade liegen, kann diese außer durch zufällige auch durch systematische Fehler bedingt sein, denn die Hill-Gleichung setzt voraus, dass der Hill-Koeffizient für alle Konzentrationen gleich ist. Eine Abweichung hiervon fandG.S. Adair, der ebenfalls die Sauerstoffbindung von Hämoglobin untersuchte.^[13]

Zusammenstellung von Linearisierungen einer Hyperbel

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$\quad$

Inhibitoren

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Hauptartikel:Enzymhemmung

VieleTherapeutika und Gifte sind Hemmstoffe (Inhibitoren) von Enzymen. Aus diesem Grunde ist der Aufklärung des Wirkungsmechanismus immer eine besondere Bedeutung zugekommen. Die Nomenklatur der Hemmtypen wurde vonWilliam Wallace Cleland (* 1930) 1963 auf eine systematische Grundlage gestellt, leider werden in vielen Lehrbüchern immer noch Begriffe abweichend verwendet.

Hier sollte allerdings beachtet werden, dass sich klassische Analysen auf reversibel bindende Stoffe beschränken. Irreversible Bindung einer Substanz an ein Enzym führt zur Inaktivierung, nicht zur Hemmung.

Abgeleitet aus derMichaelis-Menten-Gleichung $v=V_{\text{max}}\cdot [\mathrm {S} ]/(K_{m}+[{\textrm {S}}])$ stellt sich die allgemeine Inhibitionsgleichung wie folgt dar:

v={\frac {V_{\text{max}}\cdot [\mathrm {S} ]}{K_{m}(1+{\frac {[\mathrm {I} ]}{K_{i}}})+[\mathrm {S} ](1+{\frac {[\mathrm {I} ]}{K_{ii}}})}}

Danach kann das Verhältnis des $K i {\displaystyle Ki}$ -Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EI) und des $K{ii}$ -Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EIS) zur Ableitung des Inhibitionstyps dienen:

Kompetitiv

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Inhibitor und Substrat schließen sich gegenseitig von der Bindung an das Enzym aus. Dies bedeutet jedochnicht notwendigerweise, dass der Inhibitor an der gleichen Bindungsstelle bindet wie das Substrat. Auch wenn die Bindung von Substrat bzw. Inhibitor zu Konformationsänderung im Enzym führen, welche die Bindungsstelle für den jeweils anderen blockieren, ist die Hemmung kompetitiv. Wenn Substrat und Inhibitor allerdings die gleiche Bindungsstelle haben, dann ist der Hemmtyp notwendig kompetitiv.

Bei der Kompetitiven Hemmung kann der Inhibitor durch Substrat aus dem Enzym verdrängt werden, $V_{\text{max}}$ ändert sich also nicht. Allerdings wird für jede gewünschte Geschwindigkeit eine höhere $[\mathrm {S} ]$ benötigt, die scheinbare $K_{m}$ wird also mit steigender $[\mathrm {I} ]$ höher. Im Lineweaver-Burk-Diagramm führt dies bei unterschiedlichen $[\mathrm {I} ]$ beziehungsweise $K_{I}$ zu einer Schar von Geraden, die einen gemeinsamen Schnittpunkt auf der y-Achse bei ( $1/V_{\text{max}}$ ) haben.

Unkompetitiv

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Der Inhibitor bindet nicht an das freie Enzym, sondern an den ES-Komplex. Höhere Konzentrationen des Substrates können daher den Hemmstoff nicht vom Enzym verdrängen, sondern führen zu vermehrter Bindung. Umgekehrt vermindert Bindung des Hemmstoffes die Konzentration von ES, nach dem Prinzip von Le Chatelier muss sich also zusätzliches ES aus E und S bilden: Die scheinbare $K_{m}$ vermindert sich, die Affinität des Enzymes für das Substrat steigt mit steigender $[\mathrm {I} ]$ . Gleichzeitig nimmt natürlich $V_{\text{max}}$ ab. Im Lineweaver-Burk-Diagramm finden wir eine Schar paralleler Geraden.

Nicht-kompetitiv

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Der Inhibitor kann sowohl an E als auch an ES binden. Im einfachsten Fall ist dabei $K_{i}=K_{ii}$ , d. h., dass die Substratbindung die Affinität des Enzymes für den Inhibitor nicht verändert, etwa durch Konformationsänderung. Dann folgt natürlich auch, dass die Bindung des Inhibitors die Affinität des Enzymes für das Substrat nicht ändert und $K_{s}=K_{ss}$ . Wegen des Zusammenhangs zwischen $K_{s}$ und $K_{m}$ ändert die Bindung von Inhibitor also auch nicht $K_{m}$ .

Es lässt sich nun zeigen (durch Substitution und Eliminierung aus den Definitionen von $K_{i},K_{ii},K_{s}$ und $K_{ss}$ ), dass $K_{i}/K_{ii}=K_{s}/K_{ss}$ . Wenn also $K_{i}<K_{ii}$ , dann folgt $K_{s}<K_{ss}$ und die scheinbare $K_{m}$ steigt mit $[\mathrm {I} ]$ . Falls andererseits $K_{i}>K_{ii}$ , dann folgt $K_{s}>K_{ss}$ und die scheinbare $K_{m}$ sinkt mit steigendem $[\mathrm {I} ]$ .

Die nicht-kompetitive Hemmung führt im Lineweaver-Burk-Diagramm zu einer Schar von Geraden mit gemeinsamen Schnittpunkt links von der y-Achse, der Schnittpunkt liegt auf der x-Achse wenn $K_{i}=K_{ii}$ , er liegt über der x-Achse falls $K_{i}<K_{ii}$ und unter der x-Achse falls $K_{i}>K_{ii}$ .

Gemischt-kompetitive Hemmung

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Der Mechanismus dieses Hemmtyps (der in der Praxis von geringer Bedeutung ist) ähnelt der nicht-kompetitiven Hemmung, allerdings hat der EIS-Komplex noch eine katalytische Aktivität. Auch das Lineweaver-Burk-Diagramm sieht aus wie bei der nicht-kompetitiven Hemmung (mit allen 3 Möglichkeiten). Im sog. Sekundärdiagramm (Steigung bzw. y-Schnittpunkt im Lineweaver-Burk-Diagram als Funktion von $[\mathrm {I} ]$ ) sieht man aber im Falle der nicht-kompetitiven Hemmung Geraden, im Falle der gemischt-kompetitiven jedoch Kurven.

Siehe auch

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Literatur

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H. Bisswanger:Enzymkinetik – Theorie und Methoden. 3. Auflage. Wiley-VCH, Weinheim 2000,ISBN 978-3-527-30096-9.
E. Buxbaum:Fundamentals of protein structure and function. Springer, New York 2007,ISBN 978-0-387-26352-6.
G. E. Briggs, J. B. Haldane:A Note on the Kinetics of Enzyme Action. In:Biochemical Journal. Band 19, Nr. 2, 1925, S. 338–229;PMID 16743508.
W. W. Cleland:The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. In:Biochimica et Biophysica Acta. Band 67, 1963, S. 104–137, 173–187, 188–196.
R. Eisenthal, A. Cornish-Bowden:The direct linear plot. A new graphical procedure for estimating enzyme kinetic parameters. In:Biochemical Journal. Band 139, Nr. 3, 1974, S. 715–720;PMID 4854723.
J. B. S. Haldane:Graphical methods in enzyme chemistry. In:Nature. Band 179, 1957, S. 832.
V. Henri:Theorie generale de l’action de quelques diastases. In:Comptes rendues l’Academie des sciences. Band 135, 1902, S. 916–919.
A. V. Hill:The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves. In:The Journal of Physiology Band 40, Supplement, 1910, S. iv–vii.
L. Michaelis, M. L. Menten:Die Kinetik der Invertin-Wirkung. In:Biochemische Zeitschrift. Band 49, 1913, S. 333–369.
I. H. Segel:Enzyme Kinetics. Wiley, New York 1975 (Nachdruck 1993).
S. P. L. Sørensen:Enzymstudien II. Über die Messung und Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration bei enzymatischen Prozessen. In:Biochemische Zeitschrift. Band 21, 1909, S. 131–304.

Weblinks

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Wikibooks: Formelsammlung Chemie/ Spezifische Kinetiken – Lern- und Lehrmaterialien

Peter Birch:An Introduction to Enzyme Kinetics. (Memento vom 28. April 2009 imInternet Archive) Department of Biological Sciences,University of Paisley.
Private Internetseite zur Enzymkinetik

Einzelnachweise

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↑Leonor Michaelis, Maud Leonora Menten:Die Kinetik der Invertinwirkung. In:Biochemische Zeitschrift.Band 49, 1913,ISSN 0366-0753,S. 333–369,urn:nbn:de:hebis:30-1090119.
↑Die Darstellung orientiert sich in freier Formulierung derhier genannten Quelle.
↑ A.V. Hill, "The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves", J Physiol 1910, 40, S. iv–vii
↑vgl. z. B. Jachen Denoth: „Theoretische Betrachtungen zur maximalen Leistung im Ausdauersport bei einem durch die maximale Sauerstoffaufnahme begrenzten Energieverbrauch“ in: Schweizer Zeitschrift für Sportmedizin und Sporttraumatologie 2008, 65 (2), S. 77–81
↑z. B. zur Beschreibung einer Michaelis-Menten-Gleichung in: Hartmut Bossel: "Modellbildung und Simulation", Springer-Verlag, 13. März 2013, S. 271
↑Hans Bisswanger: „Enzyme: Struktur, Kinetik und Anwendungen“, John Wiley & Sons, 29. Juni 2015, Box 11.2
↑Berg/Stryer/Tymoczko: Biochemie, S. 214, Springer-Verlag, 27. Februar 2015.
↑Schemazeichnung für die aufgeführten drei Möglichkeiten inhttps://images.slideplayer.org/1/649096/slides/slide_39.jpg
↑Das Diagramm ist der englischsprachigen Wikipedia (Seite: Hill equation (biochemistry)) entnommen, der Kommentar unabhängig formuliert.
↑H. Lineweaver, D. Burk:The Determination of Enzyme Dissociation Constants. In:Journal of the American Chemical Society, 56, 1934, S. 658–666.doi:10.1021/ja01318a036.
↑Hanes, CS. (1932).Studies on plant amylases: The effect of starch concentration upon the velocity of hydrolysis by the amylase of germinated barley. In:Biochemical Journal 26: 1406–1421;PMID 16744959;PMC 1261052 (freier Volltext).
↑Das Diagramm ist der englischsprachigen Wikipedia (Seite: Hill equation (biochemistry)) entnommen, der Kommentar unabhängig formuliert.
↑'The hemoglobin system. IV. The oxygen dissociation curve of hemoglobin' in: J Biol Chem 63, 1925, S. 529–545

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Inhaltsverzeichnis

Theorie für Enzyme mit einer Substratbindungsstelle

Theorie für Enzyme mit mehreren Substratbindungsstellen

Die Hill-Gleichung und ihre Herleitung aus dem Massenwirkungsgesetz

Weitere Darstellung für θ und fürv. Die Sättigungsfunktion

Der empirische Hill-Koeffizientenn_H als Maß der Kooperativität von Enzymen

Berechnung vonn_H

Nicht linearisierte Graphen

Direkt-lineare Auftragung einer Enzymkinetik nach Michaelis-Menten

Direkt-linear aufgetragene Graphen einer Enzymkinetik nach Hill für unterschiedliche Werte vonn_H

Halblogarithmisch aufgetragene Graphen einer Hill-Gleichung für unterschiedliche Werte vonn_H

Linearisierungsverfahren

Lineweaver-Burk-Diagramm

Eadie-Hofstee-Diagramm

Scatchard-Diagramm

Hanes-Woolf-Diagramm (Hanes(-Wilkinson)-Diagramm)

Hill-Diagramm

Zusammenstellung von Linearisierungen einer Hyperbel

Inhibitoren

Kompetitiv

Unkompetitiv

Nicht-kompetitiv

Gemischt-kompetitive Hemmung

Siehe auch

Literatur

Weblinks

Einzelnachweise

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Direkt-lineare Auftragung einer Enzymkinetik nach Michaelis-Menten

Direkt-linear aufgetragene Graphen einer Enzymkinetik nach Hill für unterschiedliche Werte vonnH

Halblogarithmisch aufgetragene Graphen einer Hill-Gleichung für unterschiedliche Werte vonnH

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Scatchard-Diagramm

Hanes-Woolf-Diagramm (Hanes(-Wilkinson)-Diagramm)

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