Fosforylace jeadice fosfátových skupin (PO 3−
4 ) na proteiny nebo jiné organickémolekuly. Může měnit strukturuproteinů venzymech a tím i jejich funkci a činnost. Fosforylace proteinů hraje významnou roli v celé řadě buněčných procesů. Z tohoto důvodu se stává předmětem řady biochemických výzkumů.
V roce 1906 Phoebus A. Levene v Rockefellerově ústavu pro lékařský výzkum identifikovalfosfát v bílkovině vitellin,[1] a v roce 1933 Fritz Lipmann objevil fosfoserin v kaseinu.[2] Nicméně trvalo dalších 20 let, než Eugene P. Kennedy popsal první "enzymatickou fosforylaci proteinů".[3]
Reverzibilní fosforylace proteinů je důležitý regulační mechanismus, který se vyskytuje uprokaryotických ieukaryotických organismů.[4][5][6][7]Kinázy fosforylují bílkoviny a fosfatázy bílkoviny defosforylují. Mnohé enzymy areceptory jsou ve stavu "zapnutý" nebo "vypnutý" prostřednictvím fosforylace a defosforylace. Reverzibilní fosforylace vede ke konformačním změnám struktury mnohýchenzymů areceptorů, které způsobují aktivaci nebo deaktivaci. Fosforylace se v eukaryotických proteinech obvykle vyskytuje naaminokyselináchserin,threonin,tyrosin ahistidinových zbytcích. Histidinová fosforylace eukaryotických proteinů je častější než fosforylace natyrosinu. V prokaryotických bílkovinách dochází k fosforylaci zbytků aminokyselin serin, threonin, tyrosin, histidin,arginin nebolysin.[4][5][8][8][9] Přidánímfosfátových iontů (HPO 2-
4 ) na polární R skupinyaminokyselinových zbytků se mohou změnit hydrofobní části proteinu na polární a extrémně hydrofilní část molekuly. Tímto způsobem je možné zavést konformační změnu ve struktuře proteinu prostřednictvím interakce s jinými hydrofobními a hydrofilními částmiproteinu.Jeden takový příklad regulace je fosforylacep53 tumor supresorových proteinů. Proteinp53 je silně regulován[10] a obsahuje více než 18 různých míst fosforylace. Aktivace p53 může vést k zástavěbuněčného cyklu, který může být obrácen a za určitých okolností může vést kapoptotické buněčné smrti.[11] Tato aktivita se vyskytuje pouze v situacích, kdy jsou buňky poškozené, nebo je u zdravých jedinců narušená jejichfyziologie. Po deaktivačním signálu je protein znovu defosforylován a přestane fungovat. Aktivace fosforylací je mechanismus, který se vyskytuje v mnoha formách přenosu signálů, jako například způsob, jakým se světlo zpracovává ve světločivných buňkách sítnice.
Regulační role fosforylace:
Objasnění komplexní signální dráhy fosforylace může být obtížné. V buněčných signálních drahách protein A fosforyluje protein B a protein B pak fosforyluje protein C. Nicméně, v jiných signálních drahách protein D fosforyluje protein A, nebo fosforyluje protein C. Globální přístupy jako je fosfoproteomika (což je studium fosforylovaných proteinů prostřednictvím proteomiky v kombinaci s hmotnostní spektrometrií), byly využity k identifikaci a kvantifikaci dynamických změn fosforylovaných proteinů v průběhu času. Tyto techniky jsou důležité pro systematickou analýzu komplexních fosforylačních sítí.[15] Byly úspěšně použity k identifikaci dynamických změn ve stavu fosforylace na více než 6000 místech po stimulaci epidermálním růstovým faktorem.[16]
Jiný přístup k pochopení fosforylačních sítí je na základě měření genetické interakce mezi více fosforylovanými proteiny a jejich cíli. To ukazuje zajímavé opakující se vzorce interakcí tzv. síťové motivy.[17]
Existuje tisíce různých fosforylačních míst v dané buňce, protože:
Fosforylace jakéhokoli místa na daném proteinu může změnit funkci nebo lokalizaci tohoto proteinu. Například, pokud je aminokyselina Serin-473 ("S473") v proteinu AKT fosforylována, protein kináza B je funkčně aktivní jako kináza. Pokud protein kináza B není fosforylována, je to neaktivníkináza.
Uvnitř bílkoviny může dojít k fosforylaci na několika aminokyselinách. Fosforylace naserinu je nejčastější, hned za ním následujethreonin. Tyrosinová fosforylace je poměrně vzácná. Vzhledem k tomu, že tyrosin-fosforylované proteiny je poměrně snadné purifikovat pomocíprotilátek, jsou fosforylace prostřednictvím tyrosinu poměrně dobře prozkoumané. Fosforylace histidinu aaspartátu se vyskytují hlavně u prokaryot jako součást dvousložkové signalizace. V některých specifických případech se může vyskytovat také v signálních drahách u eukaryot.[18]
Protilátky mohou být použity jako výkonné nástroje pro detekci toho, zda je protein na určitém místě fosforylován. Protilátky vážou a detekují konformační změny vyvolané fosforylací proteinů. Tyto protilátky se nazývají fosfo-specifické. Nyní jsou k dispozici stovky těchto protilátek.[19] Jsou to důležité biochemické nástroje a to jak pro základní výzkum, tak pro klinické diagnózy.
PTM (Posttranslační modifikace) izoformy jsou snadno zjistitelné na 2D gelu. Fosforylace nahrazuje neutrálníhydroxylové skupiny na serinech a threoninech nebo tyrosinech za negativně nabité fosfátové skupiny s pKs kolem 1.2 a 6.5. PodpH 5,5 fosfáty přidají jeden záporný náboj, u pH 6,5 přidávají 1,5 záporného náboje, nad pH 7,5 přidávají 2 záporné náboje. Relativní množství každé izoformy může být také snadno a rychle určeno z intenzity zbarvení na 2D gelu.V některých velmi specifických případech, je možné detekovat fosforylaci jako posun v proteinu. Tuhle elektroforetickou pohyblivost lze provádět pomocí jednoduchých 1rozměrných SDS-PAGE gelů, jak je to popsáno například pro transkripční koaktivátor v článku Kovacs et al.[20]Většina fosforylačních míst, pro které byly tyto mobilní posuny popsány spadají do kategorie SP a TP míst. (tj. prolinové zbytky následované fosforylovanými serinovými nebo threoninovými zbytky).Nedávné rozsáhlé analýzyhmotnostní spektrometrie byly použity k určení místa fosforylace proteinů. Za poslední 4 roky, desítky studií zveřejnily každou identifikaci tisíců míst, z nichž dříve mnohé nebyly popsány.[21][22] Hmotnostní spektrometrie je ideální pro takové analýzy, pro které přidávání fosforylace vede ke zvýšení množství proteinů a fosforylovaného zbytku. Nicméně, pokročilé, vysoce přesné hmotnostní spektrometry jsou u těchto studií nezbytné, což představuje omezení pouze na laboratoře s nejmodernějšími hmotnostními spektrometry.
Podrobná charakterizace lokalit fosforylace je velmi obtížná, a kvantifikaci proteinů fosforylací pomocí hmotnostní spektrometrie vyžaduje vnitřní standardní přístupy s použitímizotopů[23]Relativní kvantifikaci lze získat s různými diferenciálními technologiemi, například označování prostřednictvím izotopů.[24] Existuje také několik kvantitativních metod proteinové fosforylace, včetně fluorescenčních a imunologických, FRET, TRF,fluorescenční polarizace,fluorescenční spektroskopie,gelová retardační analýza (EMSA), bead-based detekce (metoda pozostávající ze třech prvků: kulička (průměrem 5,6-micromů), oligomerní zachycovací sondy připojené k povrchu a tři fluorofory pro multiplexní detekci), cell-based metody (metody založené na bázi buněčných testů se vztahují na některý z řady různých experimentů založených na použití živých buněk. Tyto metody mohou obsahovat různé testy, které měří proliferaci buněk, toxicitu, motilitu, měřitelnou výrobu produktu, a morfologii buněk. Cell-based testy nabízejí přesnější vyjádření reálného života v modelu, protože jsou používány živé buňky, a také nabízejí možnost dynamického experimentu prostřednictvím sledování množství nebo chování živých buněk).[25][26]
ATP, "vysoce energetické" výměnné médium v buňce, je syntetizováno v mitochondriích přidáním třetí fosfátové skupiny na ADP v procesu nazvaném oxidační fosforylace. Další způsob tvorby ATP je syntetizace na úkor sluneční energie v procesu fotofosforylace vchloroplastech rostlinných buněk.Fosforylace cukrů je často první fáze jejichkatabolismu. To umožňuje buňkám hromadit cukry, protože fosfátová skupina brání molekulám difundovat zpátky přes jejich transportéry. Dále existuje tzv.substrátová fosforylace, při které vznikne ATP mimodýchací řetězec(např.: zGTP vznikající vCitrátovém cyklu, přiglykolýze, apod...).
V tomto článku byl použitpřeklad textu z článkuPhosphorylation na anglické Wikipedii.
{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite web}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.{{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.
Obrázky, zvuky či videa k tématufosforylace na Wikimedia Commons| Primární struktura proteinů aposttranslační modifikace | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Hlavní | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N-konec aminokyselin | Acetylace •Karbamylace •Formylace •Glykace •Methylace •Myristoylace (Gly) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| C-konec aminokyselin | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Specifickéaminokyseliny |
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Příčné vazby mezi dvěmaaminokyselinami |
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tři po sobě následujícíaminokyseliny (Chromoforová formace) |
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Příčné vazby mezi čtyřmiaminokyselinami |
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
