Listeria monocytogenes | |
|---|---|
 | |
| Dades | |
| Malaltia | listeriosi |
| Tinció de Gram | Grampositiu |
| Taxonomia | |
| Regne | Bacillati |
| Fílum | Bacillota |
| Classe | Bacilli |
| Ordre | Caryophanales |
| Família | Listeriaceae |
| Gènere | Listeria |
| Espècie | Listeria monocytogenes (Murrayet al. 1926) |
Lalistèria monocitògena (Listeria monocytogenes) és unbacterifirmicut estès a tota mena d'ambients (sòl, aigües omicrobiota fecal de diversos mamífers)[1] com asapròfit. Té la capacitat de modificar el seuproteoma si les condicions del medi canvien[2] i fer la transició apatogen intracel·lular quan és ingerit per humans i animals, un mecanismeadaptatiu singular que li permet actuar com apatogen oportunista.[3]
És l'agent causant de lalisteriosi i es considera un delspatògens d'origen alimentari mésvirulents, amb una taxa de letalitat (proporció de persones que moren a causa d'una malaltia entre el nombre total dels individus afectats per ella en un període i territori determinats) del 20-30 per cent.[4] Responsable d'aproximadament 2.500 casos i 500 morts registrats cada any als Estats Units, lalisteriosi és globalment la primera causa de mort entre lesmalalties de transmissió alimentària, superant fins i tot lasalmonel·losi i elbotulisme.[5][6]
L. monocytogenes és un bacterigrampositiu, en forma debacil, no formador d'espores,catalasa positiu,oxidasa negatiu,anaerobi facultatiu i productor d'una particular β-hemolisina (substància que causa lalisi delseritròcits i, per tant, la degradació total de l'agar sang) que rep el nom de listeriolisina O.[7] Quan l'organisme creix entre 20 i 25 °C forma un manyoc deflagels a la superfície de l'embolcall cel·lular; en canvi, a 37 °C la producció baixa notablement.[8]
Aquest bacteri va ser descobert al1924 perE. G. D. Murray a laUniversitat de Cambridge, quan estudiava la mort sobtada de sis conills icobais de laboratori que presentaven una importantmonocitosi (augment del nombre demonòcits). La seva descripció del microbi no va ser publicada fins al1926. Murray i els seus col·laboradors l'anomenaren primeramentBacterium monocytogenes,[9] però al1927 el metge d'origen escocès Harvey Pirie (1878-1965)[10] va canviar el nom aListerella hepatolytica en honor deJoseph Lister.[8] Hi va haver una gran confusió sobre la nomenclatura del microorganisme fins al1948 quan s'oficialitzà el nom actual a la 6a edició del llibreBergey's Manual of Determinative Bacteriology.[11][12]
Tot i que en la dècada de 1920 ja s'havien fet descripcions clíniques d'infeccions provocades per aquest bacteri, tant en humans com en altres animals, no va ser reconegut com a l'agent causal demeningitis,sèpsia i infeccions neonatals fins al 1952 a Alemanya.[13] El1966 Gray i Killinger van fer la primera publicació oficial sobreListeria monocytogenes i les seves diferents infeccions en humans o animals.[8]
A començaments del1980 es reconeix, finalment, la transmissió a través dels aliments deL. monocytogenes. A més a més, durant aquella dècada s'observa un augment de casos descrits de listeriosi, com els brots epidèmics de1983 i1985 a Canadà i California respectivament, que varen confirmar el paper dels aliments en la disseminació del patogen.[1] Des de llavors el bacteri s'ha vist com l'agent causant de diferents brots alimentaris arreu d'Amèrica del Nord i Europa.[8]
Al2001 es creàThe Canadian Listeriosis Reference Service[14] amb l'objectiu d'investigar els brots de listeriosicanadencs i desenvolupar una base de dades molecular d'aïllats deL. monocytogenes.[11]
Gràcies a mètodes moleculars, el total de 214soques aïllades fins al moment s'han pogut distribuir en 4llinatges diferents (I, II, III i IV). Inicialment, al 1989, van ser descoberts els dos primers, i subseqüentment es van afegir els dos últims.[15][16]
Analitzant elserotip de les soques deL. monocytogenes, basat en antigens cel·lulars (O) i antigens flagel·lars (H),[17] s'han pogut diferenciar, almenys, 13 serotips que es poden subdividir en els llinatges:[16]
Listeria monocytogenes és un bacteri present en tota mena d'ambients; des deltracte intestinal d'una gran varietat de mamífers (inclosos els humans), fins a superfícies de vegetals, una gran varietat de sòls, aigües, aliments i indústries, entre d'altres. Els indicis ecològics suggereixen que es tractaria d'un bacteri sapròfit amb la capacitat de sobreviure i replicar-se enprotozous que el depreden, una estratègia que segueixen altres tipus de microorganismes.[18][19]
No obstant això, el seu paper en la majoria d'aquests ambients no està ben caracteritzat i en molts casos se'n troben solament formes vegetatives a l'espera que les condicions siguin òptimes per al seu creixement.[18]
La seva gran diversitat de soques dificulta molt la tasca d'estudiar la seva biologia i ecologia, perquè les condicions de creixement, ambients en què persisteix, capacitat de formarbiofilms, entre d'altres aspectes, varien molt segons la soca.[20]
Kadam et al. (2013) van demostrar que un gran nombre de soques deListeria monocytogenes són formadores de biofilms amb una grandiversitat, depenent de la composició del medi (tipus de superfície) i la temperatura.[21] Hi ha soques capaces d'adherir-se a l'acer inoxidable, al vidre[22] o a superfícies de laindústria alimentària.[18] Tot i això, manquen proves que confirmin la formació de biofilms veritables perL. monocytogenes ; és a dir, de conjunts de múltiples cèl·lules ipolímers extracel·lulars que aporten protecció col·lectiva i permeten la interacció cel·lular.[18] Degut a aixòL. monocytogenes és considerat un microorganisme pobre com a formador de biofilms i quasi sempre es parla de biofilms mixtos formats a partir de la interacció entre diferents espècies bacterianes (dual-species biofilms).[20]
La formació de biofilms acostuma a estar lligada a l'obtenció de resistències aantimicrobians, però en aquest cas la biomassa viable que forma el biofilm no presenta cap dificultat a l'hora de ser eliminada d'un punt de contaminació.[23]
El concepte de fase de supervivència a llarg termini (long-term survival phase) consisteix en una sèrie de canvis bioquímics i morfològics a nivell cel·lular, que són deguts a una variació del patró d'expressió genètica, i que porten al bacteri a un estat deletargia. Això li permet aturar el seu cicle biològic i perdurar durant llargs períodes a l'espera que les condicions de creixement tornin a ser favorables.[24] Un canvi estructural del bacteri, clarament apreciable, és la transició de morfologia de bacil flagel·lat, típica de l'espècie, a una morfologia decoc sense flagels.[18] Se'n desconeixen els mecanismes biològics subjacents, però s'ha comprovat que aquest estat li permet tolerar condicions d'estrès intenses, com podrien ser-ho temperatura i pressió elevades[25] i l'exposició a agents antimicrobians com ara antibiòtics. Sembla que fins i tot podria resistir processos de neteja i desinfecció usats en la indústria alimentària, fet que justificaria la seva persistència en aquests ambients que, suposadament, no ofereixen les condicions necessàries per al seu creixement.[18]
Per una altra banda,Listeria monocytogenes té la propietat de reestructurar-se biomolecularment i conformar l'expressió de les seves proteïnes per resistir els efectes dels compostos antimicrobians naturals.[26]
Molts tipus devertebratshomeoterms sónreservoris deListeria monocytogenes. Entre ells, moltsanimals de granja i humans portadors asimptomàtics. Diversos estudisin vitro confirmen que diferents espècies denematodesbacteriofàgics i algunsartròpodes presenten el bacteri viu al tracte digestiu i també als excrements, cosa que posa aquestes espècies en el punt de mira com a possiblesvectors o reservoris del patogen.[6][20]
De forma similar a altres bacteris, com araLegionella pneumophila, altres espècies del gènereListeria o, fins i tot, algunes espècies del gènereMycobacterium,Listeria monocytogenes pot sobreviure a lafagocitosi per part deprotists depredadors de bacteris, evitar ser digerit i arribar a duplicar-se al seu interior. Aquesta estratègia justificaria la seva capacitat per esdevenir patògens ocasionals d'animals superiors, on s'ha trobat que molts mecanismes moleculars de fagocitosi per part de cèl·lules immunitàries fagocítiques estan molt conservats al llarg de lafilogènia delseucariotes.[19][27]
La capacitat de molts protozous de formarquists de resistència, podria ser una altra manera per part dels bacteris de sobreviure en condicions desfavorables. En un estudi fet amb una espècie no identificada d'Acanthamoeba, es va veure que la majoria de la població del protozou s'enquistava en resposta a una elevada densitat intracel·lular deListeria monocytogenes i, d'aquesta manera, aconseguia erradicar el bacteri i sobreviure a la seva infecció. En contraposició, altres estudis realitzats posteriorment ambAcanthamoeba castellanii[28] i diversos patògens humans relacionats amb infeccions alimentàries, es va veure queL. monocytogenes resistia el procés d'enquistament i desenquistament, i podia sobreviure en condicions desfavorables com ara la presència d'agents antibacterians durant llargs períodes. Sotmès a les mateixes condicions, el bacteri presentava una pèrdua total de viabilitat si no s'afegia el protozou al medi.[19][29]
Aquests fets posen de manifest el potencial que tenen els protozous com a vectors, reservoris i mecanisme de resistència en tota mena d'ambients, fins i tot en ambients antropogènics com indústries alimentàries, on quists d'Acanthamoeba castellanii[30] han mostrat tindre una elevada prevalença.[19][29]
Listeria monocytogenes ha estat detectat en tota mena desòls, amb una major presència en els que presenten una elevada activitat hídrica, han estat recentment cultivats o són propers a pastures. Com més alts siguin el grau d'humitat i el contingut en matèria orgànica, més prolongada es veu la seva supervivència en aquest tipus d'ambients. En un estudi dut a terme a Alemanya, es van aïllar un total de 160 soques en 746 mostres de diferents sòls i la incidència total deL. monocytogenes en les mostres va ser del 21,4 per cent.[6][18]
Un altre factor de gran rellevància és la persistència o el desenvolupament deL. monocytogenes en sòls, on forma part de lamicrobiota autòctona d'aquests ambients. S'ha comprovat que, en general, una pèrdua de diversitat i abundància d'altres microorganismes presents al sòl, facilita la implantació, supervivència i desenvolupament deL. monocytogenes. Això indica la gran pressió que exerceix aquesta microbiota autòctona sobre aquest bacteri.[6]
Segons la soca, les condicions de supervivència i creixement poden variar notablement, però un fet general és queListeria monocytogenes presenta una gran capacitat d'adaptabilitat a condicions adverses. Quan les condicions ambientals canvien progressivament, el bacteri pot romandre en estat vegetatiu o amb cicles biològics extremadament lents en condicions molt desfavorables.[31][32]
Es podria establir que un límit aproximat d'acidesa per a la supervivència deListeria monocytogenes seria de 3.35, però dependrà de la resta de factors, la soca i la rapidesa amb què canviï el pH del medi.[32]
Per tal d'eliminar elscations hidrogen que es generen a conseqüència del pH àcid, aquests cations s'acoblen a lacadena de transport d'electrons i també s'exporten activament a l'exterior mitjançantATPases que hidrolitzenATP.[31]
S'expressen dos sistemes de regulació:sistema de dos componentslisR/lisK isistema glutamat decarboxilasa (GAD)[33] que permeten augmentar el pH intracel·lular. El primer es un sistema on unacinasa d'histidina permet la detecció de les condicions àcides ambientals i una altra proteïna estableix una resposta a aquest estrès. El segon es troba compost per tres gens (gadA, gadB i gadC) que porten a terme ladescarboxilació delglutamat produint la reacció:[31][34]Elfactor sigma σB de laRNA polimerasa permet l'expressió del gengadB (component del (GAD) i del genopuC (transportador decarnitina), i paral·lelament, es sintetitzenproteases,ATP sintetases isoluts compatibles.[31]
Segons un model matemàtic, s'estima que l'activitat hídrica mínima que permet el creixement deListeria monocytogenes és de 0.49, tot i que aquesta xifra no ha estat confirmada per la dificultat que presenta la correcta determinació d'altres paràmetres que poden influir en el càlcul.[32]
Es sintetitzenproteïnes de xoc salí (Ssp)[35] iproteïnes d'aclimatació a l'estrès (Sap) on es troben: GbuA, transportadorosmoprotector de glicina betaïna (trimetilglicina),[36] i el genctc,[37] relacionat amb la resistència a elevadaosmolaritat en absència d'osmoprotectors com la trimetilglicina. També es produeixensoluts compatibles.[31]
Elfactor sigma σB de laRNA polimerasa també té una funció important i trobem unsistema de dos componentskdp[38] relacionat amb la captació de l'iópotassi (K+) produint un efecte protector davant l'alt contingut de sal.[31]
Es tracta d'un bacteri resistent a la refrigeració, malgrat que ha mostrat ser sensible a una combinació de concentracions altes de CO₂ i baixes temperatures. En condicions de laboratori algunes soques han arribat a presentar creixement fins als –0.5 °C, tot i que el més habitual és que les temperatures mínimes de creixement es trobin entre 0.5 i 5 °C en els diferents medis de cultiu, i entre 3 i 4 °C en aliments.[32] En condicions de pH àcid, salinitat elevada o de competència microbiana, (especialment debacteris de l'àcid làctic) la temperatura mínima a la qual pot créixer augmenta considerablement.[18][39]
Com adaptació a les temperatures baixes i per tal de mantenir la membrana cel·lular fluida, es produeix un augment delsàcids grassos insaturats i un augment de la proporció d'àcids pentadecanoics (C15:0) respecte elsàcids heptadecanoics (C17:0). A més a més, es dona un canvi en la forma de ramificació dels àcids grassos de iso-metil a anteiso-metil.[31] Paral·lelament es sintetitzenproteïnes de xoc fred (Csps),[40] determinatsenzims pertanyents a la família deproteïnes d'aclimatació al fred (Caps),proteases (GroEL, CIpP i CIpB) que degradenpolipèptids anormals o nocius pel microorganisme i tambésoluts compatibles, com la trimetilglicina i lacarnitina,[41] que actuen com a osmoprotectors.[31]
Quant a l'expressió gènica, a baixes temperatures elfactor sigma σB de laRNA polimerasa es troba actiu en situacions d'estrès i està relacionat amb la síntesi desoluts compatibles.[31] D'altra banda, l'expressió dels factors de virulència deListeria monocytogenes també depèn de la temperatura, i es dona a 37 °C.[18]
El procés infectiu del bacteri comprèn diverses etapes:
Lalisteriosi humana és unainfecció causada perListeria monocytogenes que es transmet principalment a través del consum d'aliments contaminats per aquest bacteri.[50] Els primers casos de listeriosi humana van ser descrits l'any 1929 per A. Nyfeldt a partir de pacients ambsepticèmia generalitzada.[11]
Listeria monocytogenes afecta amb més freqüència determinats grups de persones: ancians,individus immunocompromesos i embarassades. Tot i això, també pot afectar persones sense aquestsfactors de risc. Pot donar-se de forma esporàdica o en forma de brots.[8][11]
La principal via de transmissió és a partir del consum d'aliments contaminats, com ara carns (salsitxes, paté, pernil i pollastre), verdures,menjar precuinat amb peix o mol·luscs, llet no pasteuritzada, gelats i formatges. També existeixen altres formes de transmissió rarament vistes, com ara directament d'animals a humans, així com entre persones. En embarassades, la infecció es pot transmetre al fill a través de laplacenta o bé durant elpart si el bacteri és present a lavagina.[50]
A partir de l'anàlisi de mostres fecals es va establir que entre el 5 per cent i el 10 per cent de la població és portadora d'aquest bacteri (amb un augment considerable en el personal de laboratori) i, en menor mesura, també hi ha persones que en són portadores a la vagina.[11][50]
Laincidència de la infecció perListeria monocytogenes oscil·la entre 0,1 i 1 cas per cada 100.000 habitants per any. Es tracta d'una incidència baixa, tot i que recentment s'ha detectat un augment global del nombre de casos. Aquest increment es pensa que no estaria relacionat amb factors geogràfics ni socioeconòmics, així com tampoc amb elgènere, l'ètnia o elsserotips infecciosos; sinó amb unapoblació més vella, que presenta alguna condició que la predisposa i amb una major supervivència de la població malalta. S'ha hipotetitzat que la reducció de la concentració de sal fins a un 20 per cent en productes llestos pel consum seguint les recomanacions de les agències deseguretat alimentària l'any 2002 podria contribuir al creixement delmicroorganisme, si és que hi està present. Aquesta política s'hauria aplicat amb l'objectiu de prevenir malalties relacionades amb lahipertensió.[11][50]
Tanmateix, malgrat la baixa incidència, la listeriosi té una elevada letalitat (entre un 20 i un 30 per cent de tots els casos) tot i l'administració d'un tractament adequat i a temps. Donada la seva taxa de letalitat,[51] la listeriosi és, després de lasalmonel·losi, la segona causa de mort relacionada amb una infecció destransmissió alimentària més freqüent aEuropa i alsEUA.[11]
La infecció perL. monocytogenes té un ampli espectresimptomatològic.[11] En persones immunocompetents pot serasimptomàtica o bé desenvolupar-se com una típicagastroenteritisfebril autolimitada que desapareix en poc temps sense més complicacions (infecció no invasiva),[50] mentre que en els individus que presenten algun dels factors de risc pot causar una infecció invasiva, que es pot manifestar de tres formes diferents:[11]
A Europa aproximadament el 10-20% dels casos clínics són associats a l'embaràs, però la gran majoria es donen en persones immunocompromeses no embarassades, sobretot en gent gran.[50]
D'altra banda, també pot causar una àmplia varietat d'infeccions localitzades, com araconjuntivitis,peritonitis,osteomielitis,pericarditis,arteritis ifascitis necrosant, entre moltes altres.[50]
Elperíode d'incubació, des de l'exposició (consum de l'aliment contaminat) fins a presentar símptomes, és variable segons el tipus d'infecció: en infeccions no invasives, entre 6 hores i 10 dies; en infeccions del torrent sanguini, entre 1 i 12 dies; en infeccions del sistema nerviós central, entre 1 i 14 dies; i en infeccions neonatals, entre 17 i 67 dies.[11]
El diagnòstic de la listeriosi és complicat degut al període d'incubació i a les múltiples manifestacions clíniques. A més, com que sovint els símptomes són compatibles amb els causats per altres malalties, no se sospita aquesta possibilitat i, conseqüentment, hi ha un endarreriment en el seu diagnòstic que contribueix a la sevamortalitat.[11]
La identificació del bacteri es fa mitjançant tècniquesmicrobiològiques estàndards. Es diagnostica a partir d'uncultiu positiu. És fàcilment cultivable a partir demostres clíniques com són lasang (hemocultiu), ellíquid cefalorraquidi, elmeconi, el material obtingut de rentats gàstrics, ellíquid amniòtic, elsloquis o frotis de l'oïda de nadons. El cultiu de frotis vaginal oexcrements (coprocultiu) no és d'utilitat degut a la figura del portador. Les mostres es cultiven enplaques d'agar sang i s'incuben durant 24-48 hores a 35 °C i una atmosfera ambiental. Si el bacteri hi és, creix formant colònies petites i rodones, betahemolítiques. Cal establir un diagnòstic diferencial amb altresgrampositius, com araStreptococcus.[11][50] Patir listeriosi durant l'embaràs té conseqüències greus i és difícil de diagnosticar, de manera que caldria fer cultius de qualsevol embarassada amb febre i símptomes gastrointestinals.[50]
LaPCR és l'única tècnica de detecció ràpida utilitzada en mostres clíniques. És particularment útil quan és probable que l'administració antibiòtica prèvia hagi compromès el cultiu. Lesproves serològiques no són de caràcter diagnòstic donada la reactivitat antigènica creuada entreListeria monocytogenes i altres bacteris grampositius comStaphylococcus,Enterococcus i espècies deBacillus.[50]
És molt important iniciar el tractament tan aviat com es detecti la infecció, especialment en els casos de bacterièmia. El tractament antibiòtic consisteix en unbeta-lactàmic, normalmentpenicil·lina oampicil·lina, sol o en combinació ambgentamicina (unaminoglicòsid). No s'ha demostrat que l'addició de gentamicina suposi un avantatge, ja que l'efecte sinèrgic només s'ha observatin vitro. En el cas que s'estigui tractant una embarassada, no és recomanable l'ús de gentamicina pels possiblesefectes teratogènics.[11][50]
En el cas que el pacient fosal·lèrgic als antibiòtics beta-lactàmics, es recomana l'ús detrimetoprim/sulfametoxazole oeritromicina. Aquest últim compost pot travessar la placenta i passar al líquid amniòtic, tot i que en dosis subterapèutiques. Els experts recomanen fer servir una alternativa diferent en aquests casos. També s'ha empratvancomicina,linezolid,[55]meropenem[56] irifampicina. Es coneixen pocs aïllatsresistents a aquests antibiòtics.[11][50]
Listeria monocytogenes és resistent de forma intrínseca a l'àcid nalidíxic (CMI >128 mg/l)[57] i mostra una susceptibilitat reduïda davant algunesfluoroquinolones importants, com araciprofloxacin. Les susceptibilitats del bacteri no han patit canvis considerables que s'hagin pogut demostrar in vitro en els últims trenat-cinc anys.[50]
En general, es recomana que la duració del tractament sigui almenys de catorze dies, tot i que passat aquest temps s'han descrit recaigudes en pacients immunodeprimits tractats amb penicil·lina, de manera que caldria allargar-lo en aquests casos.[11][50]
No hi ha disponible unavacuna per laimmunització contra la listeriosi. No obstant això, als individusasimptomàtics amb unrisc elevat de patir la infecció degut a la ingesta d'un aliment implicat en unbrot, se'ls pot administrarampicil·lina otrimetoprim/sulfametoxazole durant set dies com aprevenció. En termes generals, caldria evitar el consum de carn i peix crus o poc cuinats, especialment en el cas d'embarassades.[50]
Eldiagnòstic ràpid i el tractamentantibiòtic augmenten laprobabilitat d'una evolució favorable. És imprescindible la identificació de les estratègies més eficients per l'avaluació de riscos des de laproducció dels aliments fins al moment del seu consum. En molts països no és una infecció dedeclaració obligatòria, fet que podriaesbiaixar els resultats relatius a la seva incidència, que podria ser major del que es coneix.[11]
L. monocytogenes es troba distribuïda de forma ubiqua i es pot trobar contaminant molts aliments, però el tipus de menjar involucrat amb major freqüència en els brots i en els casos esporàdics de listeriosi són els aliments a punt per consumir (en anglèsready-to-eat o RTE)processats incorrectament.[58][18]
Tot i això, durant l'elaboració d'aliments el bacteri pot arribar a contaminar qualsevol aliment per diverses vies: contacte ambfemtes, contaminació creuada, etc.[58]
El més important és saber si un determinat aliment suporta el seu creixement, cosa que ha demostrat ser molt complicat de determinar, perquè depèn de molts factors que no estan ben descrits. Alguns exemples d'aquests factors són; la soca, les condicions de preservació del aliment, si aquest ha estat tallat o perforat o si el procés deconserva té diverses fases que puguin afavorir l'aparició de nousnínxols ecològics, entre d'altres.[18]
Un exemple, seria el brot alimentari que devia el seu origen a pomes dolces, doncs ni elcaramel que les recobria ni aquesta fruita són ambients que suportin el creixement deL. monocytogenes. Es creu que la combinació d'ambdós aliments, juntament amb el pal que perfora la fruita, pot donar lloc a un nou microambient que sí suporti el creixement d'aquest patogen.[18]
Aquest exemple posa en manifest la complexitat d'aquest microorganisme i la gran dificultat que presenta a l'hora d'establir criteris microbiològics de seguretat en aliments de consum humà o animal.[18]
L'últim cas que s'ha registrat, és elbrot de listeriosi a Andalusia l'estiu del 2019, que va registrar 226 casos, deixant 3 morts i 7 avortaments. Aquest brot va sorgir de la carn entatxonada de la marca "la Mechá" produïda per l'empresa Magrudis.[59]
Inicialment, el 23 de setembre de 1999 el Comitè científic sobre mesures veterinàries relatives a la salut pública (SCVPH) de laComissió Europea[60] va establir dos límits microbiològics per als RTE que determinaven l'absència del bacteri en 25 grams de producte per a aquells aliments onL. monocytogenes rarament creix o que han patit un tractament listericida i 100ufc/g en aliments sense tractament o on el bacteri sí que pot créixer.[61]
Al 2000, a Espanya, es va generar unreial decret (RD 3484/2000),[62] on s'estableixen normes d'higiene per a l'elaboració, distribució i comerç de menjar preparat. Paral·lelament es generendirectives europees que entre el 2002-2004 es van unificar amb la publicació d'un reglament únic (CE 178/2002)[63] que harmonitza, combina i simplifica les exigències d'higiene abans detallades en les directives que cobrien la seguretat dels productes alimentaris, especialment els d'origen animal.[61]
I al 2005 s'estableix una normativa europea sobrehigiene alimentària (CE 2073/2005) que estableix els criteris microbiològics següents:[61]
| Categoria del producte | pla de mostreig | límits | Fase en la que s'aplica el criteri | |
|---|---|---|---|---|
| n | c | |||
| Aliments RTE destinats a lactants i usos mèdics | 10 | 0 | Absència en 25 grams | Productes comercialitzats durant la seva vida útil. |
| Aliments RTE que poden afavorir el creixement del microorganisme no destinats ni a lactants ni usos mèdics | 5 | 0 | 100ufc/grams d'aliment | Productes comercialitzats durant la seva vida útil. |
| 5 | 0 | Absència en 25 grams d'aliment | Abans que l'aliment hagi deixat el control immediat de la empresa que el produeix. | |
| Aliments RTE que no afavoreixen el creixement del microorganisme | 5 | 0 | 100ufc/grams d'aliment | Productes comercialitzats durant la seva vida útil. |
n: nombre de mostres a agafar d'un lot;c: nombre màxim de mostres acceptades amb resultat no satisfactori (superen el límit).
Hi ha hagut un gran debat internacionalment sobre com s'ha de regular la presència d'aquest microorganisme. En el cas de laUE i el Canadà s'estableix que en aquells aliments que han donat casos de listeriosi són regulats de forma més estricta (absència en 25 grams) que els aliments que no han donat casos de listeriosi (100ufc/grams). En canvi, als EUA i al Regne Unit mantenien criteris de tolerància 0 (absència en 25 grams) perquè que no es pot córrer cap risc de fixar un límit si la dosi infectiva es desconeguda. Tot i això, per petició popular, adscrita per 15 associacions, laFDA va adoptar el límit de 100 ufc/grams en els aliments que no permetien el creixement del microorganisme l'any 2008.[61]
El mètode de referència per aListeria monocytogenes es troba explicat en laISO 11290 on trobem mètodes de presència/absència i mètodes de recompte. Es portaran a terme mètodes de recompte o de presència/absència en funció del criteri que s'apliqui. És a dir, per exemple, en el cas de productes destinats a usos mèdics o lactants, el criteri ens indica que el límit és absència en 25 grams, i per tant, s'aplicaran mètodes de presència/absència. Mentre que en el cas de RTE que no afavoreixen el creixement del microorganisme, el límit microbiològic és de 100ufc/gram s'aplicaran mètodes de recompte.[64] Aquesta normativa fou revisada l'any 2017.[65]
S'agafen 25 grams de mostra i s'afegeixen a una bossa que conté una quantitat de brou de cultiu Half Fraser[66] 9 vegades superior al volum o pes de la mostra. Tot el contingut s'homogeneïtza de 3 segons a 3 minuts en una màquina Stomacher[67] i es deixa incubant a 301 °C durant 243h. D'aquest enriquiment primari s'agafen 0'1 ml i s'afegeixen a 10 ml de brou Fraser[68] i s'incuba durant 371 °C durant 483h. D'aquest dos enriquiments es sembren en dos medis:agar cromogènic Listeria (ALOA)[69] iagar Oxford[70] per tenir colònies aïllades i es deixen en l'estufa a 371 °C durant 243h i després altres 243h.[64][71][72][73][74]
En les plaques d'agar ALOA,Listeria monocytogenes forma colònies blaves-verdoses amb un halo opac a les 24 hores, en contraposició amb una altra espècie deListeria molt semblant que ésListeria ivanovii[75] que presenta l'halo a les 48 hores. En el cas de les plaques d'agar Oxford les colònies són de color gris envoltades per un halo negre a les 24 hores i a les 48 hores es tornen negres, a vegades amb un color verd brillant, són més grans i tenen un halo negre amb el centre de la colònia enfonsat. El primer medi conté, entre d'altres, un compost cromogènic que es degradat per labeta-glucosidasa (present enListeria monocytogenes) ifosfatidilinositol degradat per lafosfolipasa C (també present en el microorganisme). El segon medi contéesculina[76] que en presència d'ions Fe3+ forma un compostfenòlic de color negre.[64][71][72][73][74]
Per confirmar que aquestes colònies són realmentListeria monocytogenes es ressembren 5 colònies en agar de sang decavall (horse blood agar).[77] Altres mètodes de confirmació opcionals són:API Listeria,[78]PCR i altres procediments biomoleculars,[79]prova CAMP (Christie–Atkins–Munch-Petersen),[80] test d'Anton en animals,[81] etc. Com queListeria monocytogenes és molt semblant aListeria ivanovii es poden fer ressembres comparatives en medi ALOA per tal d'apreciar característiques diferencials.[64][71][72][73][74]
Es prepara un homogeneïtzat com en el cas anterior però en aigua depeptonatamponada (Buffered Peptone Water o BPW)[82] o diluentsalí de peptona (Peptone Saline Diluent o PSD)[83] i s'homogeneïtza emprant un dispositiu Stomacher entre 30 segons i 3 minuts. Es prepara la dilució 10-1 i altres dilucions, si es necessari, en PSD i es sembren en superfície una o dues plaques de medi ALOA. Si es preveu el creixement d'un nombre elevat de bacteris és preferible utilitzar un sembrador de plaques en espiral.[84] Les plaques s'incuben a 37 °C durant 48 hores, tot i que s'examinen a les 24 hores i després a les 24 hores següents.[64][71][72][73][74]
Essubcultiven 5 colònies presumptives en agar de sang de cavall i també, com a confirmació opcional, es poden usar galeries API o PCR.[64][71][72][73][74]
Finalment es calculen les ufc/g o ml que tenim. Es important remarcar que el nombre màxim de colònies per placa no ha de ser major a 150 (en el cas de la sembra en superfície), mentre que en el cas de sembra en espiral un mínim de 20 colònies per cada segment.[64][71][72][73][74][85]
.svg){kind=icon}