Hromatografija (odgrč. χρώμα:chroma, boja i γραφειν:grafein pisati) je zbirni naziv za grupu laboratorijskihtehnika za razdvajanje smjesa. Ona uključuje kretanje ispitivane smjese, rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu", čime se dijelovi smjese razdvajaju i izoliraju, te ih je moguće analizirati i kvantitativno odrediti.Hromatografija može biti analitička i preparativna. Preparativna hromatografija se bavi razdvajanjem komponenti iz smjese radi dalje obrade, te se može smatrati metodom prečišćavanja. U analitičkoj hromatografiji se obično radi sa malim uzorcima te se pokušava izmjeriti relativni omjer komponenti u smjesi.Hromatografija je jedna od vodećih analitičkih metoda i omogućava razdvajanje i kvantitativno određivanje supstanci veoma slične strukture i hemijskih osobina.Pod hromatografijom se podrazumijevaju metode razdvajanja koje se zasnivaju na različitojraspodjeli komponenata uzorka između dvije faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna) u odnosu na prvu.[1]
Prvu hromatografsku tehniku je pronašaoruski botaničarMihail Cvet1900. godine tokom svog istraživanjahlorofila. Koristio je staklenu kolonu koja je sadržavalakalcij karbonat da bi razdvojio biljnepigmente. Ovu metodu je opisao30. decembra1901. godine na 11. Kongresu naturalista i doktora (rus. "XI съезд естествоиспытателей и врачей") uSankt Petersburgu. Zanimljivo je da Mikhailovo prezime "Tsvet" na ruskom jeziku značiboja, tako da je moguće da je hromatografiju nazvao po svom prezimenu.Godine1952. britanski naučniciArcher John Porter Martin iRichard Laurence Millington Synge su dobiliNobelovu nagradu za hemiju za svoje otkriće particione hromatografije. Od tada, hromatografija se brzo razvija. Naučnici su ubrzo otkrili da se principi Tsvetove hromatografije mogu primijeniti na različite načine i varijante. U isto vrijeme, poboljšane su i unaprijeđene tehničke performanse hromatografije, omogućavajući razdvajanje veoma sličnih molekula.
Eluent je komponenta separacijskog sistema koja pokreće uzorak kroz kolonu.
Efluent je kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone.[2]
Mobilna faza je faza koja se kreće u određenom pravcu. Može biti tečna (LC) ili gasovita (GC). Mobilna faza se kreće kroz kolonu noseći uzorak koji se razdvaja.
Preparativna hromatografija služi za prečišćavanje supstanci za određene svrhe (ne za analizu).
Retenciono vrijeme je vrijeme za koje analit prođe kroz hromatografski sistem u određenim uslovima.
Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili ploči (npr.silikagel uTLC), na čijoj se površini određeno vrijeme zadržavaju supstance koje se razdvajaju.
Hromatografske metode je moguće podijeliti prema različitim kriterijima: prema fizičkom stanju faza, prema fizičko-hemijskim fenomenima koji se dešavaju prilikom razdvajanja (mehanizmu razdvajanja), itd.[3]
Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije volatilnih organskih spojeva i nekih anorganskih gasova iz smjese. GC je nastala1950. godine i danas se razvila u jednu od primarnih tehnika u hemijskoj analizi.U GC dolazi do particionisanja gasovitog uzorka između inertnog gasa kao mobilne faze i tečne ili čvrste stacionarne faze. Uređaj za GC se naziva gasni hromatograf. Kao mobilna faza (gas nosač) najčešće se upotrebljavajuhelij,nitrogen,hidrogen ili smjesaargona imetana. Izbor gasa zavisi od uzorka i detektora, a najviše se koristi helij. Uzorak se unosi pomoću injektora (manualni ili automatski) i nošen gasom prelazi u kolonu. Kolone za GC koje su se u početku koristile su tzv. pakovane kolone. Danas su u upotrebi kapilarne kolone, zbog bolje efikasnosti razdvajanja. Unutrašnji zidovi kapilarne kolone su prevučeni čvrstim poroznim materijalom ili viskoznom tečnošću. U GC se koristi više tipova detektora, čiji se izbor vrši na osnovu komponente koja se analizira.[4]
Shema uređaja za tečnu hromatografiju: A-rezervoar mobilne faze;B-ventil za miješanje i pumpa;C-drain ventil;D-uređaj za kontrolu pritiska;E-komora za miješanje (mikser);F-injektor;G-kolona;H-HPLC komponenta;I-detektor;J-kontroler;K-kompjuter;L-štampač
Tečna hromatografija (LC) je razdvajanje supstanci na osnovu distribucije između čvrste stacionarne faze i tečne mobilne faze. Postoje dva tipa LC: klasična i LC visokih performansi (HPLC). Klasična LC koristi velike kolone, dužine i do 50cm, pakovane poroznim materijalom, a mobilna faza prolazi gravitaciono, pa je stoga mali protok i metoda nije efikasna. HPLC je moderna analitička tehnika kod koje se mobilna faza dovodi pomoćupumpe. Uzorak se ubacuje pomoću manualnog ili automatskog injektora. Kolone za HPLC su punjenesilikatnim ilipolimernim materijalom. Postoji više tipova detektora za HPLC. Najčešće se koristi UV-VIS detektor, a osim njega i fotodiodni, fluorescentni, elekrohemijski i drugi.Na osnovupolarnosti razlikuje se LC na normalnim i obrnutim fazama. Razdvajanje na normalnim fazama podrazumijeva da je stacionarna faza polarna (npr. silikatna), a mobilna faza nepolarna (nprheksan). Kod razdvajanja na obrnutim fazama stacionarna faza je nepolarna (npr. C-18hidrokarbon), a mobilna faza polarna (npr.voda imetanol).[5]
Tankoslojna hromatografija (TLC) koristi tanki sloj (0.10 – 0.25mm)adsorbirajućeg materijala (silikagel,aluminij oksid,celuloza) nanesen na čvrsti nosač odstakla,aluminija iliplastike. Uzorak rastvoren u odgovarajućemrastvaraču se nanosi u vidu mrlje na jednu stranu ploče, na udaljenosti 1cm od ivice. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji kapilarnim silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom komponente uzorka, koje se kreću do određene udaljenosti na ploči. Zbog različitog afiniteta komponente se zaustavljaju na različitim mjestima na ploči, što omogućava njihovu identifikaciju (razvijanjem boje ili posmatranjem podUV lampom).[3]
Ionoizmjenjivačka hromatografija (IEC) ili ionska hromatografija je tehnika koja ima dosta sličnosti saHPLC tehnikom. Kao stacionarna faza koriste se umrežene polimerne smole (najčešće polistirenske umrežene pomoću divinil-benzena), na koje sukovalentno vezane ionskefunkcionalne grupe. Te grupe su neutralisaneionima suprotnog naboja i mogu biti zamijenjeni ionima koji su prisutni u ispitivanom uzorku. Zavisno od afiniteta, ioni će se različito vrijeme zadržavati na stacionarnoj fazi, što omogućava njihovo razdvajanje. Generalno, ionoizmjenjivač favorizira vezanjeiona većeg naboja i manjegradijusa. Kao mobilna faza najčešće se upotrebljavajupuferi.[6]
Ekskluziona hromatografija je metoda kod koje se separacija komponenata vrši na osnovu veličine čestica. Kao stacionarna faza koriste se porozni materijali (silikagel ili polimerne smole). Manje čestice mogu ući u pore stacionarne faze i zadržavaju se duže vremena. Veće čestice koje su prisutne u uzorku ne mogu ući u pore i eliuraju se prije. Ovaj tip hromatografije se naziva još igel-filtracija ili hromatografija na molekularnim sitima.Engleski naziv jesize exclusion chromatography, pa se koristi akronim SEC. Ova metoda je pogodna za razdvajanjeproteina.[3]
Superkritična fluidna hromatografija (SFC) je metoda kod koje je mobilna faza gas natemperaturi ipritisku iznad kritičnih vrijednosti (pod ovim uslovima mobilna faza je superkritični fluid – niti je gas niti tečnost). Superkritični fluidi imajuviskoznost sličnugasovima, pa lahko prolaze kroz kapilarne i pakovane kolone bez potrebe za visokim pritiskom kao kodHPLC metode.Gustoća superkritičnih fluida je sličnatečnostima, pa se ponašaju kaorastvarač. Najčešće se koristi CO2. Njegovakritična temperatura je 31°C ikritični pritisak 72.9atm što se relativno lahko postiže.[6]
