ERCC4 jestprotein koji je kodljudikodirangenomERCC4 sahromosoma 16. To jeprotein označen kaoendonukleaza zapopravak DNK XPF. Zajedno saERCC1, ERCC4 formiraenzimski kompleks ERCC1-XPF koji učestvuje upopravcima DNK iDNK rekombinaciji.[5][6]
Enzimnukleaza ERCC1-XPF siječe specifične strukture DNK. Mnogi aspekti ova dva genska proizvoda su ovdje opisani zajedno jer su oni partneri tokompopravka DNK. ERCC1-XPF nukleaza je esencijalna aktivnost na putu DNKpopravka dekscizijom nukleotida (NER). ERCC1-XPF nukleaza također funkcionira na putevima za popravkuprekid dvostrukog lanca u DNK, te u popravljanju oštećenja "poprečnog povezivanja" koje štetno povezuje dva lanca DNK.
Ćelije s onemogućujućimmutacijama uERCC4 su osjetljivije nego normalno na određene agense koji oštećuju DNK, uključujućiultraljubičasto zračenje i na hemikalije koje uzrokuju umrežavanje između lanaca DNK.Genetički modificirani miševi saonemogućujućim mutacijama uERCC4 također imaju defekte u popravku DNK, praćene promjenama u fiziologiji izazvanim metaboličkim stresom koje rezultiraju preranimstarenjem.[7] PotpunadelecijaERCC4 nije kompatibilna sa održivošću miševa, a nisu pronađene ljudske individue s potpunom (homozigotnom) delecijomERCC4. Rijetke osobe u ljudskoj populaciji imaju naslijeđene mutacije koje narušavaju funkcijuERCC4. Kada su normalni geni odsutni, ove mutacije mogu dovesti do ljudskihsindroma, uključujućixeroderma pigmentosum,Cockayneov sindrom iFanconijevu anemiju.
ERCC1 iERCC4 su imena ljudskih gena, aErcc1 iErcc4 suanalogna imena gena sisara. Slični geni sa sličnim funkcijama nalaze se u svimeukariotskim organizmima.
Ljudski genERCC4 može ispraviti defekt popravka DNK u specifičnim mutantnim ćelijskim linijama osjetljivim na ultraljubičasto svjetlo (UV) izvedene iz ćelijajajnika kineskog hrčka.[8] Izolirane su višestruke nezavisne komplementarne grupe ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO),[9] i ovaj gen je obnovio otpornost na UV zračenje na ćelije komplementarne grupe 4. Odražavajući ovaj metod genetičke komplementacije među vrstama, gen je nazvan "unakrsni komplementarni popravak ekscizije 4"[10]
Ljudski "ERCC4" gen kodira XPF protein od 916aminokiselina s molekulskom masom od oko 104.000 daltona.
Geni sličniERCC4 sa ekvivalentnim funkcijama (ortolozi) nalaze se u drugim eukariotskim genomima. Neki od najviše proučavanih genskih ortologa uključuju „RAD1“ u pupajućem kvascuSaccharomyces cerevisiae i „rad16+“ u fisijskm kvascuSchizosaccharomyces pombe.
Po jedna molekula ERCC1 i XPF se vežu zajedno, formirajući ERCC1-XPFheterodimer koji je aktivni nukleazni oblik enzima. U ERCC1–XPF heterodimeru, ERCC1 posreduje u interakcijama DNK- iprotein-protein. XPF osigurava aktivno mjesto endonukleaze i uključen je u vezivanje DNK i dodatne interakcije protein-protein.[8]
ERCC4/XPF protein se sastoji od dva konzervirana područja odvojena manje konzerviranim regionom u sredini.N-terminalno područje ima homologiju s nekoliko konzerviranih domena DNK-helikaza koje pripadaju natporodici II, iako XPF nije DNK helikaza.[11]C-terminalni region XPF-a uključuje ostatkeaktivnog mesta za aktivnost nukleaze.[12](slika 1).
Većina ERCC1 proteina je povezana na nivou sekvence sa C-terminalom XPF proteina.,[13] ali ostaci u domenu nukleaze nisu prisutni. DNK-vezujući "heliks-ukosnica-heliks" domen naC-terminalu svakog proteina.
Po primarnoj sekvenci i strukturnoj sličnosti proteina, ERCC1-XPFnukleaza je član šire porodice strukturno specifičnih DNK-nukleaza koje se sastoje od po dvije podjedinice. Takve nukleaze uključuju, na primjer, nukleazu MUS81-EME1.
Dužinapolipeptidnog lanca je 916aminokiselina, amolekulska težina 104.486Da.[6]
| 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MESGQPARRI | AMAPLLEYER | QLVLELLDTD | GLVVCARGLG | ADRLLYHFLQ | ||||
| LHCHPACLVL | VLNTQPAEEE | YFINQLKIEG | VEHLPRRVTN | EITSNSRYEV | ||||
| YTQGGVIFAT | SRILVVDFLT | DRIPSDLITG | ILVYRAHRII | ESCQEAFILR | ||||
| LFRQKNKRGF | IKAFTDNAVA | FDTGFCHVER | VMRNLFVRKL | YLWPRFHVAV | ||||
| NSFLEQHKPE | VVEIHVSMTP | TMLAIQTAIL | DILNACLKEL | KCHNPSLEVE | ||||
| DLSLENAIGK | PFDKTIRHYL | DPLWHQLGAK | TKSLVQDLKI | LRTLLQYLSQ | ||||
| YDCVTFLNLL | ESLRATEKAF | GQNSGWLFLD | SSTSMFINAR | ARVYHLPDAK | ||||
| MSKKEKISEK | MEIKEGEETK | KELVLESNPK | WEALTEVLKE | IEAENKESEA | ||||
| LGGPGQVLIC | ASDDRTCSQL | RDYITLGAEA | FLLRLYRKTF | EKDSKAEEVW | ||||
| MKFRKEDSSK | RIRKSHKRPK | DPQNKERAST | KERTLKKKKR | KLTLTQMVGK | ||||
| PEELEEEGDV | EEGYRREISS | SPESCPEEIK | HEEFDVNLSS | DAAFGILKEP | ||||
| LTIIHPLLGC | SDPYALTRVL | HEVEPRYVVL | YDAELTFVRQ | LEIYRASRPG | ||||
| KPLRVYFLIY | GGSTEEQRYL | TALRKEKEAF | EKLIREKASM | VVPEEREGRD | ||||
| ETNLDLVRGT | ASADVSTDTR | KAGGQEQNGT | QQSIVVDMRE | FRSELPSLIH | ||||
| RRGIDIEPVT | LEVGDYILTP | EMCVERKSIS | DLIGSLNNGR | LYSQCISMSR | ||||
| YYKRPVLLIE | FDPSKPFSLT | SRGALFQEIS | SNDISSKLTL | LTLHFPRLRI | ||||
| LWCPSPHATA | ELFEELKQSK | PQPDAATALA | ITADSETLPE | SEKYNPGPQD | ||||
| FLLKMPGVNA | KNCRSLMHHV | KNIAELAALS | QDELTSILGN | AANAKQLYDF | ||||
| IHTSFAEVVS | KGKGKK |
ERCC1–XPF kompleks je strukturno specifičnaendonukleaza. ERCC1-XPF ne siječe DNK koja je isključivo jednolančana ili dvolančana, ali cijepa fosfodiestersku kičmu DNK, posebno na spojevima između dvolančane i jednolančane DNK. Uvodi rez u dvolančanu DNK na 5′ strani takvog spoja, udaljenog oko dvanukleotida[14](slika 2). Ova specifičnost strukture prvobitno je pokazana za RAD10-RAD1, ortologe kvasca ERCC1 i XPF.[15]
Hidrofobni motivi heliks–ukosnica–heliks uC-terminalnim regijama ERCC1 i XPF međusobno djeluju kako bi promovirali dimerizaciju dva proteina.[16][17] Nema katalitske aktivnosti u odsustvu dimerizacije. Zaista, iako je katalitski domen unutar XPF-a i ERCC1 je katalitski neaktivan, ERCC1 je neophodan za aktivnost kompleksa.
Predloženo je nekoliko modela za vezivanje ERCC1–XPF za DNK, na osnovu parcijalnih struktura relevantnih proteinskih fragmenata pri atomskoj rezoluciji.[16] Vezivanje DNK posredovano domenima heliks-ukosnica-heliks domena ERCC1 i XPF pozicioniraheterodimer na spoju između dvolančane i jednolančane DNK.
Tokompopravka ekscizijom nukleotida, nekoliko proteinskih kompleksa sarađuje kako bi prepoznali oštećenu DNK i lokalno odvojili spiralu DNK na kratku udaljenost s obje strane mjesta oštećenja DNK. ERCC1–XPF-nukleazaurezuje oštećeni lanac DNK na 5′ strani lezije.[14] Tokom NER-a, ERCC1 protein stupa u interakciju sa XPA proteinom, kako bi koordinirao DNK i vezivanje proteina.
Ćelije sisara sa mutiranim ERCC1–XPF umjereno su osjetljivije od normalnih ćelija na agense (kao što jeionizirajuće zračenje) koji uzrokuju dvolančane lomove u DNK.[18][19] Određeni putevi i popravkehomologne rekombinacije i nehomolognog spajanja kraja oslanjaju se na funkciju ERCC1-XPF.[20][21] Relevantna aktivnost ERCC1–XPF za oba tipa popravke dvolančanog prekida je sposobnost uklanjanja nehomolognih 3′ jednolančanih repova sa krajeva DNK prije ponovnog spajanja. Ova aktivnost je potrebna tokom podputahomologne rekombinacije jednolančanog izduživanja. Podrezivanje jednolančanih repova od 3’ je također potrebno u mehanički različitom podputu nehomolognog spajanja krajeva, neovisno o Ku-proteinima.[19][22] Homologna integracija DNK, važna tehnika za genetičku manipulaciju, ovisi o funkciji ERCC1-XPF u ćeliji domaćinu.[23]
Ćelije sisara koje nose mutacije u ERCC1 ili XPF posebno su osjetljive na agense koji uzrokuju međulančane umrežavanje DNK (ICL)[24] Međulančane umrežene veze blokiraju napredovanjereplikacija DNK, a strukture na blokiranim viljuškama replikacije DNK obezbjeđuju supstrate za cijepanje pomoću ERCC1-XPF.[20][25] Incizije se mogu napraviti sa obe strane ukrštene veze na jednom lancu DNK, kako bi se poprečna veza otkačila i započela popravka. Alternativno, dvolančani prekid može biti napravljen u DNK u blizini ICL-a, a naknadna popravkahomologne rekombinacije uključuje djelovanje ERCC1-XPF. Iako nije jedina uključenanukleaza, ERCC1–XPF je neophodan za popravak ICL-a tokom nekoliko fazaćelijskog ciklusa.[26][27]
Neke osobe s rijetkim nasljednim sindromomxeroderma pigmentosum imaju mutacije u ERCC4. Ovi pacijenti su klasifikovani kao XP komplementaciona grupa F (XP-F). Dijagnostičke karakteristike XP-a su suha ljuskavakoža, abnormalna pigmentacija kože na područjima izloženim suncu i teška fotosenzibilnost, praćena velikim od 1.000 puta povećanim rizikom od razvojakarcinoma kože izazvanogUV-zračenjem.[5]
|Većina pacijenata s XP-F pokazuje umjerene simptome XP-a, ali nekoliko pokazuje dodatne simptomeCockayneovog sindroma.[28] Pacijenti s Cockayneovim sindromom (CS) pokazuju fotosenzitivnost, a također imaju razvojne nedostatke i neurološke simptome.[5][7]
Mutacije u genu ERCC4 mogu rezultirati vrlo rijetkim XF-Esindromom.[29] Ovi pacijenti imaju karakteristike XP i CS, kao i dodatne neurološke, hepatobilijarne, muskuloskeletne i hematopoetske simptome.
Nekoliko ljudi sa simptomimaFanconijeve anemije(FA) ima uzročne mutacije u ERCC4 genu. Fanconijeva anemija je složena bolest koja uključuje glavnehematopoetske simptome. Karakteristična oznaka FA je preosjetljivost na agense koji uzrokuju umrežavanje međulančanih DNK. FA pacijenti sa ERCC4mutacijama klasifikovani su kao pripadnici Fanconijeve anemije komplementarne grupe Q (FANCQ).[28][30]
ERCC4 (XPF) je normalno eksprimiran na visokom nivou u ćelijijedrima unutar unutrašnje površinedebelog crijeva (pogledajte sliku, panel C). Unutrašnja površina debelog crijeva obložena je jednostavnim stubastimepitelom sainvaginacijama. Invaginacije se nazivajucrijevne žlijezde ili kripte debelog crijeva. Kripte debelog crijeva su oblikovane kaomikroskopske epruvete sa debelim zidovima sa centralnom rupom niz dužinu epruvete (kriptalumena). Kripte su dugačke oko 75 do 110 ćelija.Popravka DNK, koja uključuje visoku ekspresiju ERCC4 (XPF), PMS2 i ERCC1 proteina, izgleda da je vrlo aktivna u kriptama debelog crijeva u normalnom epitelu debelog crijeva koji nijeneoplazijaski.
Ćelije se stvaraju u bazi kripte i migriraju prema gore duž ose kripte prije nego što se prebace ulumen debelog crijeva dan kasnije.[32] U bazama kripti postoji 5 do 6matičnih ćelija.[32] Postoji oko 10 miliona kripti duž unutrašnje površine prosečnog ljudskogdebelog crijeva.[31] Akomatične ćelije u bazi kripte eksprimiraju ERCC4 (XPF), općenito će svih nekoliko hiljada ćelija kripte također eksprimirati ERCC4 (XPF). Ovo je naznačeno smeđom bojom koja se vidi imunobojanjem ERCC4 (XPF) u skoro svim ćelijama u kripti na panelu C slike u ovom odeljku. Slična ekspresija PMS2 i ERCC1 javlja se u hiljadama ćelija u svakoj normalnoj kripti debelog creva.
Odsječaktkiva na slici prikazanoj ovdje također je kontrabojenjem obojenhematoksilinom, kako bi se DNK u jedrima obojila u plavo-sivu boju.Ćelijska jedra ulamina propria, ćelije koje se nalaze ispod i okružujuepitelne kripte, hematoksilinom uglavnom pokazuju plavo-sivu boju i imaju malu ekspresiju PMS2, ERCC1 ili ERCC4 (XPF). Osim toga, ćelije na samim vrhovima kripti obojene na PMS2 (panel A) ili ERCC4 (XPF) (panel C) imaju niske razine ovih proteina za popravku DNK, tako da takve ćelije također pokazuju plavo-sivu boju DNK.[31]
ERCC4 (XPF) je deficitaran u oko 55% karcinoma debelog crijeva i u oko 40% kripti debelog crijeva u epitelu unutar 10 cm u blizini karcinoma (udefektima polja iz kojih su karcinomi vjerovatno nastali).[31] Kada je ERCC4 (XPF) smanjen u kriptama debelog crijeva u defektu polja, to je najčešće povezano sa smanjenom ekspresijom enzima zapopravak DNK ERCC1 i PMS2, kao što je ilustrovano u slika u ovom odeljku. Čini se da su nedostaci ERCC1 (XPF) u epitelu debelog crijeva posljedicaepigenetičkog potiskivanja.[31] Nedostatak ERCC4 (XPF) bi doveo do smanjene popravke oštećenja DNK. Kao što ukazuju Harper i Elledge,[33] defekti u sposobnosti pravilnog reagovanja i popravljanja oštećenja DNK leže u osnovi mnogih oblika raka. Česta epigenetička redukcija ERCC4 (XPF) kod defekta polja koji okružujukarcinom debelog crijeva, kao i kod karcinoma (zajedno sa epigenetičkim smanjenjem ERCC1 i PMS2) ukazuje da takva smanjenja često mogu imati centralnu ulogu u progresiji do raka debelog crijeva.
Iako je epigenetičko smanjenje ekspresije ERCC4 (XPF) često kod karcinoma debelog crijeva kod ljudi, mutacije u ERCC4 (XPF) su rijetke kod ljudi.[34] However, a mutation in ERCC4 (XPF) causes patients to be prone to skin cancer.[34] Čini se da je naslijeđeni polimorfizam u ERCC4 (XPF) važan i kodraka dojke.[35] Ove rijetke mutacijske promjene naglašavaju vjerovatnu ulogu nedostatka ERCC4 (XPF) u progresiji doraka.
