Uczęszczał do Louden Moor School, Darvel School iKilmarnock Academy, a następnie podjął studia medyczne na Regent Street Polytechnic wLondynie (obecnieUniversity of Westminster)[1][2], po czym przez 4 lata pracował w biurze[1]. Gdy został spadkobiercą dużego majątku po zmarłym wuju[2][3], za namową brata[3] w 1901 r. podjął studiamedyczne w St. Mary’s Medical School naUniwersytecie Londyńskim[2][1]. Początkowo zamierzał zająć sięchirurgią, ale znajomi namówili go, by przyjął pracę w grupie badawczejAlmrotha Wrighta, gdzie zainteresował się bakteriologią. W chwili wybuchuI wojny światowej w 1914 r. został członkiem Korpusu Medycznego Brytyjskiej Armii Królewskiej w randze kapitana. Tam zwrócił uwagę na dużą liczbę zgonów żołnierzy z powodu zakażeń. Kiedy skończyła się I wojna światowa, Fleming powrócił do pracy w St. Mary’s Medical School[1][3].
W 1922 r. odkrył, że w tkankach i wydzielinach ludzkiego ciała znajduje się substancja zdolna do rozpuszczania (lizy) niektórych bakterii. Ze względu na podobieństwo do enzymów nazwał jąlizozymem. Wyizolował też bakterię, która była wrażliwa na działanie lizozymu i nazwał jąMicrococcus lysodeikticus (później okazało się, że była to znana już wcześniejMicrococcus luteus), a została pobrana przez Fleminga prawdopodobnie z własnego nosa. Swoje odkrycie opisał w artykule wProceedings of the Royal Society B: Biological Sciences[4].
W 1928 r. badał nietypowe szczepy bakterii z rodzajuStaphylococcus. W lipcu pozostawił w laboratorium płytki zaszczepione tymi bakteriami i udał się na wakacje. Po powrocie, 3 września, razem z przyjacielem i wcześniejszym współpracownikiem,Danielem Prycem przeglądał uzyskane kolonie bakterii. Na jednej z nich zauważyli zakażenie pleśnią, wokół której był obszar czysty od bakterii. Pryce zwrócił uwagę, że przypomina to sytuację, gdy Fleming odkrył lizozym i nie przywiązał większej uwagi do zaobserwowanego zjawiska, natomiast Fleming podjął dalsze badania[4]. W 1929 r. badacz wspomniał o swoim odkryciu na łamachBritish Journal of Experimental Pathology[5]. Po kilku latach długotrwałych eksperymentów odkryłpenicylinę G, która działa silnie bakteriobójczo, a łagodnie dla człowieka. Badania zostały jednak wstrzymane z powodu braku środków finansowych. W 1945 otrzymałNagrodę Nobla w dziedzinie medycyny, razem zHowardem Floreyem iErnstem Chainem, którzy zdołali wyizolować odkrytą przez niego substancję[3].
Badacz przewidział, że penicylina stosowana w niewłaściwy sposób może w przyszłości wywoływaćoporność na antybiotyki[5].
Słynnym jego powiedzeniem było: „To natura wyprodukowała penicylinę, ja ją tylko odkryłem”[6]. Resztę życia Fleming przepracował w Szpitalu Świętej Marii. W 1943 został wybrany członkiem Towarzystwa Królewskiego, rok później otrzymał tytuł szlachecki. W 1948 nadano mu tytuł Profesora Bakteriologii Uniwersytetu Londyńskiego[1].