游戏的剧情发生在《刺客信条II》故事的15年之后，主人公也是II的主角埃齐奥·奥迪托雷·达·佛罗伦萨（Ezio Auditore da Firenze）。当他来到15世纪的西班牙，去解放那些被西班牙宗教法庭的幌子下监禁的跟随他的刺客们。在这个过程中，埃齐奥发现圣殿骑士团计划向西航行去发现新大陆。埃齐奥必须救下Christoffa Corombo或克里斯托弗·哥伦布，并且杀死托马斯·托尔克马达以消除圣殿骑士的威胁。 埃齐奥也不得不暗杀其他一些重要的目标，如：加斯珀·马丁内斯，佩德罗·略伦特，圣殿骑士的间谍以及胡安·德·马里罗。
　　一路上，埃齐奥救了很多人帮助他的刺客，包括路易斯·圣地亚戈和拉斐尔·桑切斯。格拉纳达市在圣殿骑士们的围困之下，埃齐奥还必须救下摩尔国王穆罕默德十二世。埃齐奥也遇到了伊莎贝拉女王。