前作において初号機のコアに取り込まれたレイとは異なる、三人目のユイのクローンとなる「アヤナミレイ（仮称）」が登場。EVANGERION Mark.09に搭乗し、着用するプラグスーツの色は、白を基調としていた綾波レイとは対照的に、黒を基調としたものになっている。
ゲンドウの命令を受け、ヴィレの戦艦AAAヴンダーをMark.09で襲撃し、シンジを新設NERVへ連行する。シンジが第10使徒から命懸けで守ろうとしたレイとは似て異なる存在（別人）であるため、彼のことは名前以外ろくに知らず、無関心な接し方しかしなかった。ゲンドウの命令には忠実に従う。
その後、第13号機のセントラルドグマ降下を支援してアスカの改2号機と交戦し、ヴンダーのシステムを乗っ取ろうとしたところを、獣化第2形態へ移行した改2号機に組み付かれて自爆攻撃を受けるが、エントリープラグで脱出したために無事だった。マリいわく、「アダムスの器」。
前作まで登場していた綾波レイの生存は、本作では明かされておらず不明。また、本作ではレイがシンジの母・ユイのクローンであることが明確に明かされ、ユイの旧名が「綾波ユイ」であった事実が、冬月によってシンジに告げられている。